Микроскопические методы исследования морфологии бактерий и грибов
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели препаровальные иглы.
Приготовление препарата для изучения микроорганизмов в нативном виде. Метод «висячей капли». Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат. Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. После микроскопии препараты «раздавленной» капли или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидком виде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать. Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 15-20 мин. в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт и другие фиксирующие жидкости.
.
МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ
Простой метод. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать. Сложные методы. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоты и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Окрас методом Грама является сложным методом.
На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.
Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.
Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
Промыть водой.
Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.
ЗНАКОМСТВО С МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ТЕХНИКОЙ. РАБОТА С БИОЛОГИЧЕСКИМ МИКРОСКОПОМ.
Для микроскопических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный и другие) и специальные методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный и др.).При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка в работе:
на приготовленный и окрашенный мазок на предметном стекле нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;
повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива Х90;
осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла;
установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;
провести окончательную фокусировку препарата микроскопическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота..
По окончании работы с микроскопом необходимо вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив Х8.
13 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Выращивание (культивирование) микроорганизмов используется в лабораторных и производственных условиях для выделения, накопления и сохранения микроорганизмов. Для культивирования микроорганизмов используют специальные питательные среды, которые должны содержать необходимые питательные вещества и являться оптимальной средой обитания микроорганизмов. В состав питательной среды обязательно входят 5 основных элементов ( С, Н2, О2, N) и зольные элементы, микроэлементы, количество воды не менее 60%. Универсальных сред, пригодных в равной степени для всех микроорганизмов, не существует. В закономерности от особенностей обменных процессов (фотосинтез, способы получения энергии) отдельным видам микроорганизмам требуются различные составы питательных веществ. По составу питательные среды подразделяются на 2 группы: - естественные - искусственные. Естественными называются среды, которые состоят из натуральных пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство из них применяют в виде экстратов или настоев. Эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов. Они используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами служат мясопептонный бульон, почвенная вытяжка, картофельная среда. Искусственные среды (синтетические среды) - это среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды удобны для использования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение. Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют. К ним можно отнести: гидролизат козеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт. По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические среды. Элективные среды обеспечивают развитие одного вида или группы микроорганизмов и непригодны для развития других. Элективные среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного местообитания или для получения накопительных культур. Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды позволяют достаточно быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы позволить четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида. Индикаторные среды применяются в клинической бактериологии, при генетических исследованиях. По физическому состоянию различают: жидкие, плотные, сыпучие среды. Жидкие среды широко применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы. Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний) для хранения культур, количественного учета микроорганизмов. Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся: отруби, кварцевый песок, разваренное пшено. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый гель. Агар-агар - сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не использует его в качестве питательного субстрата. в воде агар-агар образует гели которые плавятся при 1000С, а затвердевает при 400С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при любой подходящей для их роста температуре. Выделение чистых культур м/организмов. Количественный учет м/организмов Чистой культурой м/организмов называют культуру одного вида, выращенного как потомство одной клетки. Методы выделения чистых культур м/организмов основаны на изоляции одной микробной клетки от массы м/организмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов. Наиболее распространенным способом выделения чистых культур является посев смеси микробов на плотные питательные смеси с целью получения отдельных колоний культур, которые считают результатом развития одной клетки. Для посева чаще используют агаризованные Среды в чашках Петри. Основной задачей метода является разведении концентрации м/организмов в исследуемом материале с таким расчетом , чтобы при посеве его на питательную среду выросли изолированные колонии. Существуют два основных метода разведения исследуемого материала: 1) на поверхности плотной питательной Среды; 2) предварительное разведение материала в физиологическом растворе. Метод на поверхности плотной Среды используется для выделения чистых культур аэробныхи факультативно анаэробных м/организмов. С этой целью для посева берут ряд чашек Петри с плотной средой. В первую чашку наносят мсследуемый материал и распределяют его по поверности шпателем. Затем производят посев последовательно на поверхность Среды в остальных чашках. Количество материала,внесенного в среду, при этом последовательно убывает. Метод предварительного разведения используется для выделения чистых культур м/организмов как аэробных, так и анаэробных. Готовят разведение материалав 10-100 раз и более и производят посев разведений, пользуясь поверхностным или глубинным методом. Выделение чистых культур строгих анаэробов требует условий выращивания без доступа кислорода. 1. Морфологические свойства – форма клеток, размеры, подвижность, способность к образованию спор, возраст культуры и др. 2. Культурные свойства м/организмов устанавливают по особенностям роста на питательных средах. на жидкихпитательных средах отмечают: характер распределения культуры в жидкости (равномерное, придонное или поверхностное), мутность сред, вид плеки, осадка. На плотных питательных средах исследуют характер колоний. Различают поверхностные и глубинные колонии. Отмечают форму, профиль, блеск и цвет. 3. Физиологические свойства м/организмов обусловлены ферментативной активностью: отношение к кислороду (тип дыхания), тип роста ( рост у дна пробирки, рост шляпкой вверх, рост равномерный по всей длине укола). 4. Протеалитические свойства (способность расщеплять белковые вещества) определяют по выделению из питательной Среды газо-продуктов расщепления белка. Чтобы определить общее количество м/организмов в различных субстратах, выявить и учесть численность представителей отдельных групп и видов м/организмов применяют методы: 1) прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках) 2) выделение и учет высевом на плотные среды 3) выделение и учет высевом на жидкие Среды (метод пред-ых разведений) Методы прямого подсчета клеток под микроскопом дают возможность учесть численность м/организмов в субстрате полностью. Но при этом определяются всеживые и мертвые клетки. И подсчет может быть не точным. Этот метод не дает представления какие процессы происходят в субстрате. Методами высева на плотные и жидкие Среды учитываются только жизнеспособные клетки м/организмов.
14Брожение Жизнь микробов возможна и без доступа кислорода воздуха. Энергия, необходимая для жизнедеятельности организма, в этих условиях образуется в результате процессов брожения. Наиболее распространены виды брожений, в процессе которых происходит распад органических веществ (преимущественно Сахаров) под влиянием микроорганизмов, представляющий совокупность окислительно-восстановительных реакций. Брожения никогда не приводят к полному окислению органических веществ. Многие характерные формы брожения протекают беэ участия кислорода воздуха — анаэробно.
Поскольку свободный кислород, имеющийся на нашей планете, образовался в результате фотосинтеза, возникшего на более поздних этапах развития жизни на Земле, совершенно очевидно, что анаэробный способ извлечения энергии — брожение — более древний, чем процесс дыхания.
Брожение известно людям с незапамятных времен. Тысячелетиями человек пользовался спиртовым брожением при изготовлении вина. Еще раньше было известно о молочнокислом брожении. Люди употребляли в пищу молочные продукты, готовили сыры. При этом они не подозревали, что эти процессы происходят с помощью микроорганизмов. Термин «брожение» был введен голландским алхимиком Ван Хельмонтом в XVII в. для процессов, идущих с выделением газов (fermentatio — кипение). Затем в XIX в. основоположник современной микробиологии Луи Пастер показал, что брожение является результатом жизнедеятельности микробов, и установил, что различные брожения вызываются разными микроорганизмами.
Спиртовое брожение — это процесс окисления углеводов, в результате которого образуются этиловый спирт, углекислота и выделяется энергия.
Сбраживание сахаров известно с глубокой древности. В течение столетий пивовары и виноделы использовали способность некоторых дрожжей вызывать спиртовое брожение, в результате которого сахара превращаются в спирт.
Брожение производят главным образом дрожжи, а также некоторые бактерии и грибы. В различных странах для получения спирта используют различные микроорганизмы. Например, в Европе используют в основном дрожжи из рода Saccharomyces, в Южной Америке — бактерии Pseudomonas lindneri, в Азии — мукоровые грибы.
Сбраживаться могут лишь углеводы, и притом весьма избирательно. Дрожжи сбраживают только некоторые 6-углеродные сахара (глюкозу, фруктозу, маннозу).
Схематично спиртовое брожение может быть изображено уравнением
Процесс
спиртового брожения — многоступенчатый,
состоящий из цепи химических реакций.
Превращения глюкозы до образования
пировиноградной кислоты происходят
так же, как и при дыхании. Эти реакции
происходят без участия кислорода
(анаэробно). Далее пути дыхания и брожения
расходятся.
При спиртовом брожении пировиноградная кислота превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Эти реакции протекают в две стадии. Сначала от пирувата отщепляется СО2 и образуется уксусный альдегид; затем уксусный альдегид присоединяет водород, восстанавливаясь в этиловый спирт. Все реакции катализируются ферментами. В восстановлении альдегида участвует НАД-H2.
Обычно при спиртовом брожении, кроме главных продуктов, образуются побочные. Они довольно разнообразны, но присутствуют в небольшом количестве: амиловый, бутиловый и другие спирты, смесь которых называется сивушным маслом — соединение, от которого зависит специфический аромат вина. Образование побочных веществ связано с тем, что превращение глюкозы частично идет другими путями.
Биологический смысл спиртового брожения заключается в том, что образуется определенное количество энергии, которая запасается в форме АТФ, а затем расходуется на все жизненно необходимые процессы клетки.
Молочнокислое брожение. При молочнокислом брожении конечным продуктом является молочная кислота.
С этим брожением люди знакомы издавна. Сквашивание молока, приготовление простокваши, кефира, квашение овощей — результаты молочнокислого сбраживания сахара молока или углеводов растений. Этот вид брожения осуществляется с помощью молочнокислых бактерий, которые подразделяются на две большие группы (в зависимости от характера брожения): гомоферментативные, образующие из сахара только молочную кислоту, и гетероферментативные, образующие, кроме молочной кислоты, спирт, уксусную кислоту, углекислый газ.
Гомоферментативное молочнокислое брожение вызывают бактерии рода Lactobacillus и стрептококки. Они могут сбраживать различные сахара с 6-ю (гексозы) или 5-ю (пентозы) углеродными атомами, некоторые кислоты. Однако круг сбраживаемых ими продуктов ограничен.У молочнокислых бактерий нет ферментативного аппарата для использования кислорода воздуха. Кислород для них или безразличен, или угнетает развитие.
Молочнокислое брожение может быть описано уравнением
Процесс образования молочной кислоты чрезвычайно близок к процессу спиртового брожения. Глюкоза также расщепляется до пировиноградной кислоты. Но затем ее декарбоксилирование (отщепление СО2), как при спиртовом брожении, не происходит, так как молочнокислые бактерии лишены соответствующих ферментов. У них активны дегидрогеназы (НАД). Поэтому пировиноградная кислота сама (а не уксусный альдегид, как при спиртовом брожении) принимает водород от восстановленной формы НАД и превращается в молочную кислоту. В процессе молочнокислого брожения бактерии получают энергию, необходимую им для развития в анаэробных условиях, где использование других источников энергии затруднено.
Гетероферментативное молочнокислое брожение — процесс более сложный, чем гомоферментативное: сбраживание углеводов приводит к образованию ряда соединений, накапливающихся в зависимости от условий процесса брожения. Одни бактерии образуют, помимо молочной кислоты, этиловый спирт и углекислоту, другие — уксусную кислоту; некоторые гетероферментативные молочнокислые бактерии могут образовывать различные спирты, глицерин, маннит.
Гетероферментативное молочнокислое брожение вызывают бактерии рода Lactobacterium и рода Streptococcus. Химизм этих брожений изучен не так хорошо, как спиртового или гомоферментативного молочнокислого брожения.
Гетероферментативные бактерии образуют молочную кислоту иным путем. Последняя стадия — восстановление пировиноградной кислоты до молочной — та же самая, что и в случае гомоферментативного брожения. Но сама пировиноградная кислота образуется при ином расщеплении глюкозы — гексозомонофосфатном. Выход энергии гораздо меньше, чем при спиртовом брожении.
Молочнокислое брожение широко используется при выработке молочных продуктов: простокваши, ацидофилина, творога, сметаны. При производстве кефира, кумыса наряду с молочнокислым брожением, вызываемым бактериями, имеет место и спиртовое брожение, вызываемое дрожжами. Молочнокислое брожение происходит на первом этапе изготовления сыра, затем молочнокислые бактерии сменяются пропионово кислыми.
Молочнокислые бактерии нашли широкое применение при консервировании плодов и овощей, в силосовании кормов. Чистое молочнокислое брожение применяется для получения молочной кислоты в промышленных масштабах.Молочная кислота находит широкое применение в производстве кож, красильном деле, при выработке стиральных порошков, изготовлении пластмасс, в фармацевтической промышленности и во многих других отраслях. Молочная кислота также нужна в кондитерской промышленности и для приготовления безалкогольных напитков.
15Пропионовокислое брожение. Химизм процесса, возбудители. Практическое использование пропионовокислого брожения
Вызывается пропионовокислыми бактериями, относящимися к роду Propionibacterium.
Единственным источником энергии для пропионовокислых бактерий является процесс сбраживания различных веществ: моносахаридов (гексоз, пентоз), молочной, яблочной кислот, глицерина и других в пропионовую и уксусную кислоту, диоксид углерода и воду.
Химизм пропионовокислого брожения:
ЗС6H12О6 > 4СНзCH2СООН + 2СНзСООН + 2CO2 + 2H2O +Е
глюкоза пропионовая уксусная
кислота кислота
Пропионовокислые бактерии - небольшие, неподвижные грамположительные палочки, не образующие спор, факультативные анаэробы. Обитают, в основном, в кишечном тракте жвачных животных и в молоке.
Практическое применение пропионовокислого брожения
Пропионовокислое брожение используется в сыроделии. Летучие кислоты (пропионовая и уксусная) придают сырам кисловато-острый вкус, а выделяющийся в виде пузырьков углекислый газ образует «глазки» в сыре.
У пропионовокислых бактерий обнаружена способность к активному синтезу витамина В1, поэтому они используются в качестве продуцента в микробиологической промышленности для получения этого витамина.
Маслянокислое брожение. Химизм процесса. Возбудители. Практическое использование и роль в процессах порчи пищевых продуктов
Маслянокислое брожение - анаэробное окисление органических веществ маслянокислыми бактериями в масляную кислоту.
Химизм процесса:
С6H12О6 > СНзСН2СН2СООН + 2 С02 + 2Н2 +Е
глюкоза масляная кислота
Возбудители маслянокислого брожения
Маслянокислые бактерии относятся к роду Clostridium. Это крупные, подвижные грамположительные палочки, образующие устойчивые споры, при образовании которых клетка приобретает форму веретена или теннисной ракетки, облигатные (строгие) анаэробы.
Маслянокислые бактерии широко распространены в природе. Обитают там, где много органических веществ и нет доступа воздуха - в иловых отложениях водоемов, навозе, почве и т.д.
Эти бактерии могут сбраживать многие углеводы, в т. ч. (крахмал, гликоген, пектиновые вещества, целлюлозу), спирты (этиловый, маннит, глицерин) и аминокислоты. По характеру используемых субстратов маслянокислые бактерии делятся на две группы: сахаролитические клостридии, которые сбраживают в основном углеводы (Ctostridium butyricum) и протеопитические клостридии, которые разлагают белки и пептоны до аминокислот и затем их сбраживают (Clostridium sporogenes, Clostridium subterminalis, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum).
Практическое значение маслянокислого брожения. Маслянокислое брожение используется в промышленности для получения масляной кислоты (продуцент Clostridium butyricum). Хотя масляная кислота обладает резким, неприятным запахом прогорклого масла, ее эфиры отличаются приятным ароматом: метиловый эфир имеет яблочный запах, этиловый - грушевый, амиловый - ананасный. Эфиры масляной кислоты используют в кондитерской, безалкогольной, парфюмерной промышленности.
Маслянокислые бактерии участвуют в круговороте веществ в природе. С другой стороны, маслянокислые бактерии могут вызвать массовую гибель картофеля и овощей, вспучивание сыров, порчу консервов, прогоркание масла и маргарина, увлажненной муки и других продуктов, чем наносят большой урон народному хозяйству. Борьба с маслянокислыми бактериями затруднена из-за высокой устойчивости спор.
16понятие аэробных брожений.К аэробным (окислительным) процессам брожения относятся биохимические реакции, вызываемые микроорганизмами и протекающие с участием кислорода воздуха. Примерами таких брожений может быть уксуснокислое и лимоннокислое.Уксуснокислое брожение вызывается уксуснокислыми аэробными бактериями, которые превращают спирт (в слабых растворах) в уксусную кислоту, при этом выделяется вода и энергия. Схема брожения следующая:
ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ + КИСЛОРОД ---> УКСУСНАЯ КИСЛОТА + ВОДА + ЭНЕРГИЯ
На уксуснокислом брожении основано промышленное получение уксуса для пищевых целей. Вместе с тем уксуснокислые бактерии могут вызывать прокисание вина, пива, кваса, ягод, салатов и других продуктов.
Лимоннокислое брожение вызывают некоторые плесневые грибы (например, грибы из рода аспергиллюс), способные окислять сахар в растворах в лимонную кислоту, при этом выделяются вода и энергия. Схема брожения следующая:
САХАР + КИСЛОРОД ---> ЛИМОННАЯ КИСЛОТА + ВОДА + ЭНЕРГИЯ
Образование грибами лимонной кислоты используется в промышленности (при изготовлении кондитерских изделий, сиропов, газированных напитков, в кулинарии и др.).
17Гниение
Микроорганизмы играют большую роль в процессах разрушения белковых веществ. Последние в громадном масштабе происходят в природе, являясь составной частью круговорота веществ.
Обычно гниением называют целый ряд внешне сходных, а по существу весьма различных процессов. Это порча мяса, рыбы, плодов, овощей, древесины, а также процессы, происходящие в почве, навозе и др.
В более узком понимании гниением принято считать процесс разложения белков или субстратов, богатых белком, под влиянием микроорганизмов.
Разрушение молекул белка микроорганизмами ведётся с различных позиций - одни продукты расщепления необходимы в качестве пластического материала для построения своего тела, другие используют их как энергетический материал. Последние вызывают более глубокий распад.
С этих позиций порчу древесины, в которой крайне мало белка, нельзя назвать гниением. Термин «гниение» неприменим также к портящимся фруктам и овощам, в которых основная масса сухого вещества приходится на углеводы. Кроме того, следует иметь в виду, что плоды, ягоды, овощи являются живыми организмами и к ним более применимо понятие «микробиологическое заболевание», а не «гниение».
Расщеплять белки с помощью выделенных во внешнюю среду ферментов способны многие микроорганизмы.
Некоторые виды гнилостных бактерий расщепляют белки до пептонов и аминокислот. Другие вызывают более полное расщепление белка с образованием более простых азотистых и безазотистых продуктов - индола, скатола, фенола, жирных кислот, аммиака, метана, углекислоты, водорода. Многие из этих соединений отличаются неприятным запахом.
Гниение легко протекает как при доступе воздуха, так и в условиях полного анаэробиоза.
Первые этапы микробиологического воздействия на белки всегда сводятся к протеолитическому расщеплению сложной белковой молекулы в зависимости от глубины процесса на отдельные составные части - пептоны, полипептиды и аминокислоты.
Схематично этот этап сводится к следующему:
+HO +HO
Белок > Пептоны > Полипептиды > Аминокислоты
Дальнейшие превращения могут протекать по двум различным направлениям.