84.Методы в генетике человека. Цитогенетические методы. Кариотип человека.

Генеалогический метод, Популяционный метод., Близнецовый метод. Цитологический метод, Биохимический метод.

Цитогенетические методы исследования применяют для диагностики хромосомных болезней. Они включают:

• исследования полового хроматина - определение Х- и Y-хроматина;

• кариотипирование (кариотип - совокупность хромосом клетки) - оп­ределение количества и структуры хромосом с целью диагностики хро­мосомных болезней (геномных мутаций и хромосомных аберраций).

Определение Х- и Y-хроматина

Определение Х- и Y-хроматина часто называют методом экспресс-диагностики пола. Исследуют клетки слизистой оболочки ротовой полости вагинального эпителия или волосяной луковицы. В ядрах клеток женщин в диплоидном наборе присутствуют две хромосомы X, одна из которых пол­ностью инактивирована (спирализована, плотно упакована) уже на ранних этапах эмбрионального развития и видна в виде глыбки гетерохроматина, прикреплённого к оболочке ядра. Инактивированная хромосома X называет­ся половым хроматином или тельцем Барра. Для выявления полового Х-хроматина (тельца Барра) в ядрах клеток мазки окрашивают ацетарсеином и пре­параты просматривают с помощью обычного светового микроскопа. В норме у женщин обнаруживают одну глыбку Х-хроматина, а у мужчин её нет. Для выявления мужского Y-полового хроматина (F-тельце) мазки окра­шивают акрихином и просматривают с помощью люминисцентного микро­скопа. Y-хроматин выявляют в виде сильно светящейся точки, по величи­не и интенсивности свечения отличающейся от остальных хромоцентров. Он обнаруживается в ядрах клеток мужского организма. Отсутствие тельца Барра у женщин свидетельствует о хромосомном за­болевании - синдроме Шерешевского-Тернера (кариотип 45, ХО). При­сутствие у мужчин тельца Барра свидетельствует о синдроме Кляйнфелтера (кариотип 47, XXY). Определение Х- и Y-хроматина - скрининговый метод, окончательный диагноз хромосомной болезни ставят только после исследования кариотипа.

Кариотипирование

Для изучения хромосом чаще всего используют препараты кратковремен­ной культуры крови, а также клетки костного мозга и культуры фибробластов. Доставленную в лабораторию кровь с антикоагулянтом подвергают центрифугированию для осаждения эритроцитов, а лейкоциты инкубируют в культуральной среде 2-3 дня. К образцу крови добавляют фитогемагглютинин, так как он ускоряет агглютинацию эритроцитов и стимулирует деление лимфоцитов. Наиболее подходящая фаза для исследования хромо­сом - метафаза митоза, поэтому для остановки деления лимфоцитов на этой стадии используют колхицин. Добавление этого препарата к культу­ре приводит к увеличению доли клеток, находящихся в метафазе, то есть в той стадии клеточного цикла, когда хромосомы видны лучше всего. Каждая хромосома реплицируется (производит свою копию) и после соот­ветствующей окраски видна в виде двух хроматид, прикреплённых к цен­тромере, или центральной перетяжке. Затем клетки обрабатывают гипото­ническим раствором хлорида натрия, фиксируют и окрашивают. Для окраски хромосом чаще используют краситель Романовского-Гимзы, 2% ацеткармин или 2% ацетарсеин. Они окрашивают хромосомы целиком, равномерно (рутинный метод) и могут быть использованы для выявления численных аномалий хромосом человека. Для получения детальной картины структуры хромосом, идентификации (определения) отдельных хромосом или их сегментов используют различ­ные способы дифференциального окрашивания. Наиболее часто приме­няют методы Гимза, а также G- и Q-бендинга. При микроскопии препарата по длине хромосомы выявляется ряд окрашенных (гетерохроматин) и неокрашенных (эухроматин) полос. Характер поперечной исчерченности, получаемый при этом, позволяет идентифицировать каждую хромосому в наборе, так как чередование полос и их размеры строго индивидуальны и постоянны для каждой пары.Метафазные пластинки отдельных клеток фотографируют. Из фотогра­фий вырезают индивидуальные хромосомы и наклеивают их по порядку на лист бумаги; такая картина хромосом называется кариотипом.Применение дополнительного окрашивания, а также новые методы по­лучения хромосомных препаратов, позволяющих растягивать хромосомы в длину, значительно увеличивают точность цитогенетической диагностики.Для описания кариотипа человека разработана специальная номенкла­тура. Нормальный кариотип мужчины и женщины обозначают как 46, XY и 46, XX соответственно. При синдроме Дауна, характеризующемся нали­чием дополнительной хромосомы 21 (трисомия 21), кариотип женщины описывают как 47, XX 21+, а мужчины - 47, XY, 21+. При наличии струк­турной аномалии хромосомы необходимо указать изменённое длинное или короткое плечо: буквой р обозначают короткое плечо, q - длинное пле­чо, t - транслокацию. Так, при делеции короткого плеча хромосомы 5 (синдром «кошачьего крика») женский кариотип описывают как 46, XX, 5р-. Мать ребёнка с транслокационным синдромом Дауна - носительница сба­лансированной транслокации 14/21 имеет кариотип 45, XX, t(14q; 21q). Транслокационная хромосома образуется при слиянии длинных плеч хро­мосомы 14 и 21, короткие плечи при этом теряются.

Каждое плечо разделяется на районы, а они в свою очередь - на сегмен­ты, и те и другие обозначают арабскими цифрами. Центромера хромосомы является исходным пунктом для отсчёта районов и сегментов.

Таким образом, для топографии хромосом используют четыре метки: но­мер хромосомы, символ плеча, номер района и номер сегмента в пределах данного района. Например, запись 6р21.3 означает, что речь идёт о хро­мосоме 6-й пары, её коротком плече, районе 21, сегменте 3. Существуют ещё дополнительные символы, в частности pter - конец короткого плеча, qter - конец длинного плеча.

Цитогенетический метод исследования позволяет обнаружить делеции и другие изменения в хромосомах только размером приблизительно в 1 млн оснований (нуклеотидов).