Методы аналитической биохимии

Методы аналитической биохимии широко применяются при подозрении на наследственные болезни обмена. На первом этапе обследования (экспресс-диагностика) применяются методы массо­вого биохимического скрининга: пробы Феллинга (на фенилкетонурию), Альтгаузена (гликогенозы), Бенедикта (галактоземия, фруктоземия), проба на гипераминоацидурию, микробиологиче­ский тест Гатри (фенилкетонурия и другие аминоацидопатии). Эти пробы достаточно просты и используют легко доступный биологи­ческий материал (кровь, моча).

На втором этапе (уточняющая диагностика) применяются более сложные методы аналитической биохимии и молекулярной биологии. В числе первых:

• исследование метаболического пути (количественное опре­деление метаболитов, их кинетики и накопления);

• прямое измерение концентрации (иммунохимические мето­ды), активности (энзимодиагностика), физико-химических и кине­тических параметров мутантных белков;

• исследование мутантных белков с помощью нагрузочных проб меченными субстратами и гибридизации соматических кле­ток;

• исследование структуры мутантного гена методами рестрик- ционного анализа.

Кроме того, разработаны высокоэффективные методы фракци­онирования и количественного анализа различных органических соединений, позволяющие выявлять маркеры определенных мета­болитов аминокислотного, углеводного и липидного обменов.

Большие перспективы открываются с применением жидкостной и газовой хроматографии, позволяющих определить аминокислот­ный состав образцов в течение нескольких минут.

Молекулярно-цитогенетические и

молекулярно биологические методы

Молекулярно-цитогенетические и молекулярно-биологические методы — это методы исследования молекулярной структуры ДНК

.

Значительная роль принадлежит методу флюоресцентной ш вид гибридизации (Р15Н), имеющему ряд преимуществ в сравнении с гибридизацией, сочетающейся с радиоактивным мечением: более точная локализация гибридизационного сигнала на хромосоме, проведение анализа за 2—3 дня, безопасность нерадиоактивной метки (что не требует специального оборудования), одновременное использование не одного, а нескольких ДНК-зондов с различной цветовой окраской. Для эффективного применения Р15Н-метода (например, для идентификации хромосом, фрагментов онкогенов, фрагментов гена инсулина и пр.) необходимо наличие коллекции меченных биотином ДНК-зондов, а также адекватных систем де­текции с помощью флюоресцентной микроскопии.

Исключительно особое место занимает ДНК-диагностика или ДНК-зондовая диагностика. Следует отметить, что методы прямой ДНК-зондовой диагностики сегодня позволяют диагностировать заболевание на уровне первичного молекулярного дефекта — пато­логического гена. Ее точность в установлении причины наследст­венного дефекта абсолютная.

Основными методами ДНК-диагностики являются: дозовый блот —гибридизационный анализ, анализ полиморфизма длин ре-стрикционных фрагментов (ПДРФ), полимеразная цепная реакция (ПЦР), анализ полиморфизма микросателлитных последовательно­стей. Благодаря этим методам у врачей появились уникальные возможности эффективного применения в различных областях ме­дицины самых совершенных технологий.

Иными словами, речь идет о наиболее разработанной области, наиболее адекватном, объективном и высоко информативном под­ходе: ДНК-диагностике моногенных болезней, вирусных и бакте­риальных инфекций, рака, оценке риска мультифакториальных заболеваний. Все это, особенно в последние годы, стало превра­щаться в стандартные средства современной медицины в развитых странах. Поскольку ДНК остается стабильной в течение всей жизни индивида, то, например, говоря о моногенных болезнях, с помощью ДНК-диагностики можно проводить эффективную пресимптома-тическую, пренатальную и даже преимплантациониую диагностику уже в первом триместре беременности. Это относится к таким болезням, как гемофилия А и В, миодистрофия Дюшенна-Беккера, муковисцидоз, спинальная амиотрофия, ФКУ и ряд других.

В случае адреногенитального синдрома, благодаря ПД, можно проводить профилактическое дородовое лечение, существенно сни­жающее тяжесть болезни после рождения ребенка. При болезни Вильсона-Коновалова своевременная пресимптоматическая ДНК-диагностика также позволяет провести профилактическое дородо­вое лечение.

В случае хореи Гентингтона пресимптоматическая диагностика имеет решающее значение для планирования семьи.

Очевидны перспективы ДНК-диагностики вирусных и бактери­альных инфекций, включая детские инфекции, инфекции, переда­ваемые половым путем, СПИД и некоторые другие.

Огромное значение имеет ДНК-диагностика рака, гематологи­ческих и эндокринных заболеваний, мультифакториальных болез­ней. В частности, разработана диагностическая система по анализу химерного гена, присутствующего в филадельфийской хро­мосоме.

С открытием целого ряда генов, участвующих в детерминации пола, оказалось достаточным проведение не многочисленных исс­ледований кариотипа, а только одного анализа, дополняемого оцен­кой состояния системы генов, участвующих в формировании пола. Среди них гены: ТОР (короткое плечо У-хромосомы), 5КУ (терми­нальный конец короткого плеча У-хромосомы), \\Т (короткое плечо хромосомы 11), АМС (амелогениновый ген, локализованный в псевдоаутосомных областях Х- и У-хромосом),

Особенности ДНК-диагностики

Наиболее важной особенностью ДНК-диагностики является выявление специфических нуклеотидных последовательностей в ДНК с помощью блот-гибридизации, предложенной еще в 1975 году. Эта методика является универсальной технологической осно­вой.

Сущность заключается в следующем: ДНК, выделенная из био-птата любого органа или ткани, клеток культуры лимфоцитов периферической крови, подвергается растеплению рестрикционны-ми нуклеазами (рестриктазами), которые "узнают" в ней строго определенную последовательность нуклеотидов. Это своеобразные "биологические ножницы" (в настоящее время получены рестрик-тазы, "узнающие" более 500 специфических последовательностей нуклеотидов с длиной от 4 до 8 и более пар).

Важно отметить, что несмотря на нарезание эндонуклеазами множества фрагментов ДНК различной длины, их набор для каж дого конкретного индивида всегда постоянен по количеству и величине (для данной рестриктазы).

Далее из множества нарезанных рестриктазой фрагментов нуж­но найти один или несколько с определенной последовательностью и охарактеризовать их.

С этой целью полученную смесь фрагментов ДНК подвергают электрофорезу. В результате фрагменты разделяются по размеру (мелкие в геле мигрируют быстрее больших).

Затем разделенные фрагменты "перепечатывают" на фильтр, фиксируют на нем и подвергают гибридизации с зондом (олигонук-леотидом), интенсивно меченным радиоактивным изотопом или флюоресцентной меткой.

Зонд является ключевым элементом. Это клонированная генно-инженерными методами нуклеотидная последовательность конк­ретного гена или последовательность, синтезированная искус­ственно.

Именно зонд выявляет необходимый фрагмент, если он присут­ствует среди исследуемого множества фрагментов. При этом про­исходит специфическое связывание последовательностей зонда с комплементарными ему последовательностями фрагмента, зафик­сированного на фильтре.

После этого следует отмывка несвязанной с фильтром радиоак­тивной метки и экспозиция фрагмента на рентгеновской пленке. Изменение положения фрагмента по сравнению с контролем, его исчезновение или появление нового фрагмента свидетельствуют о перестройках последовательностей нуклеотидов в исследуемом гене или его ближайшем окружении.

В настоящее время в ДНК-диагностике выделяют 4 подхода. Они применяются в зависимости от того, известен или не известен ген данного заболевания (1), клонирован или нет этот ген или ДНК-копия его тРНК или кодирующей ДНК (2), известна или нет природа мутации, вызывающей заболевание (3), насколько широко распространена данная мутация в различных случаях данного забо­левания в данной популяции, данном географическом регионе (4).

Первый подход предполагает прямое выявление мутаций (про­тяженная делеция, инверсия, транслокация). Уже известно не­сколько десятков наследственных болезней, связанных с такими мутациями (изолированный дефицит гормона роста, серповидно-клеточная анемия и др.).

Второй подход применяется для выявления точковых мутаций, не затрагивающих сайтов узнавания рестриктаз. Абсолютное боль­шинство болезней обусловлено такими мутациями (фенилкетону-рия, гемоглобинопатии, недостаточность альфа-1-антитрипсина

Третий подход основан на семейном анализе распределения нормальных сайтов узнавания рестриктаз в гене, изучении Поли­морфизма Длин Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ).

В некодирующих областях структурных генов (интронах) встре­чаются нейтральные по отношению к фенотипу вариации последо­вательностей, но они наследуются по менделевскому типу, что может обусловить появление или исчезновение сайтов узнавания рестриктаз. В результате при блот-гибридизации выявляются вари­абельные полиморфные рестрикционные фрагменты.

С помощью различных форм ПДРФ оказалось возможным у конкретных семей маркировать как нормальные, так и патологиче­ские гены и определять их наличие у членов данной родословной, осуществлять пренатальную диагностику, например, при фенилке-тонурии.

Четвертый подход наиболее ярко демонстрирует возможности и достоинства ДНК-диагностики и ее универсальность.

В этом случае можно диагностировать даже те заболевания, для которых не известны ни мутантные гены, ни первичные биохими­ческие дефекты, т. к. анализируемый участок не обязательно должен быть локализован в гене, но и вне его на достаточном близком расстоянии, чтобы частота рекомбинаций между маркером болезни и полиморфным маркером была как можно ниже.

Трудность заключается в подборе тесно сцепленных с маркером болезни ПДРФ-зондов, первоначально найденных для хореи Ген-тингтона, а затем для ряда Х-сцепленных заболеваний и др.

К другим современным методам относятся полимеразная реак­ция и полимеразная цепная реакция (ПЦР), позво­ляющие проводить амплификацию небольших ДНК-фрагментов, что еще больше повышает разрешающую способность.

Генно-инженерными методами идентифицируются различные олигонуклеотидные последовательности — праймеры, из которых создаются базы данных.

Из этих баз данных подбираются нужные праймеры, соответст­вующие тем или иным известным генам (фрагментам гена). Затем проводится попарная амплификация отобранных праймеров с ис­следуемым образцом и дозовый анализ амплификатов. Наличие двойной или тройной дозы амплифицированного фрагмента позво­ляет локализовать ген и охарактеризовать спектр мутаций.

К числу других молекулярно-биологических методов относятся методы исследования белков (уровень биохимической реакции) и анализа промежуточных продуктов метаболизма.

Методы генотерапии

Генотерапия—это этиологическая коррекция наследственной патологии путем введения в соматические или половые клетки полноценных (функционально активных) генов вместо или помимо имеющегося поврежденного гена, т. е. генотерапия направлена на компенсацию нарушенных функций клетки на генетическом уров­не.

В разработках проблем генотерапии решаются две взаимосвя­занные задачи: создание оптимальных способов введения экзоген­ной генетической информации в клетки человека и создание условий для регулируемой экспрессии генов, экзогенно введенных в клетки, включая совершенствование методов регистрации такой экспрессии.

Уникальность генотерапии как наиболее эффективного метода лечения и профилактики наследственных болезней заключается в следующем.

Во-первых, в "больные" клетки вводится не генный продукт (как, например, инсулин при сахарном диабете), а постоянно работающий "нормальный" ген, что в принципе избавит больного от ежедневных инъекций и других обременительных процедур, неизбежных при многих тяжелых заболеваниях.

Во-вторых, уже начаты исследования на экспериментальных животных по коррекции генетического аппарата половых клеток, что должно позволить в недалеком будущем избавить человечество от ряда тяжелых заболеваний.

О генотерапии впервые заговорили в конце 70-х годов и тогда же было предсказано, что к концу XX столетия будут проведены первые клинические испытания методов генотерапии. Эти предска­зания сбылись: впервые методы генотерапии были успешно приме­нены в клинике в 1990 году для лечения недостаточности аденозиндеаминазы и семейной гиперхолестеринемии.

Спектр наследственных заболеваний, для которых возможно применение методов генотерапии, быстро расширяется. В настоя­щее время в той или иной степени подготовки находятся системы для генотерапии сотен различных наследственных болезней. Уче­ными различных стран (Англия, Германия, Израиль, Италия, США, Франция и Япония) сегодня предпринимаются попытки генной коррекции СПИДа, артритов, болезни Паркинеона, серповидно-клеточной анемии, проводятся исследования по получению проти-вометастатических генов, созданию иммунитета против столбняка и других тяжелых инфекций.

Достаточно широк и продолжает увеличиваться список генов для терапии рака. Так, для продукции иммунного ответа использу­ются гены цитокинов, аллоантигена или опухоль — ассоциирован ного антигена. Для продукции цитотоксического или антипроли-феративного ответа используются гены-самоубийцы, супрессоры опухолей или антисенсовые гены.

Предложен нетривиальный подход к проблеме лечения с по­мощью методов генотерапии некоторых инфекционных болезней человека, основанный на эволюционно закрепленных генетических механизмах защиты против различных заболеваний у разных видов диких животных.

В целом следует заключить, что уже много полезного сделано для успешного решения задач в области генотерапии различных заболеваний:

• с помощью векторов (специальные переносчики генетиче­ ской информации) и безвекторным методом обеспечено контроли­ руемое введение генетического материала в клетки человека (клетки крови, кожи, мозга, мышц, печени и т. д.)

• созданы условия для регулируемой экспрессии вводимых в клетки генов;

• выяснено, что помимо структурного гена в полноразмерной форме или в виде кодирующей ДНК необходимо также вводить регуляторные последовательности в определенной ориентации, иногда различающейся в зависимости от целей генотерапии.

Вероятно, наибольший успех генотерапии может быть достигнут в том случае, если станет возможным интеграция генов в составе тех дискретных структур (доменов), в которых они существуют в хромосомах донора. Однако это пока трудно осуществимо техниче­ски для большинства генов, но все-таки не для всех.

Важной особенностью клинического применения методов гено- ( терапии является то, что для каждого случая коррекции недоста­точности генетических функций должен быть разработан свой! протокол. Например, в США сегодня таких протоколов около 100.1 Шансы на успех в каждом случае расцениваются примерно в 60 —1 70%.