Пиролиз микроорганизмов.

В пиролитической газо-жидкостной хроматографии идентификации подвергают газообразные продукты термической деградации микроорганизмов при пиролизе. Метод позволяет с точностью определить род, вид и даже штамм изучаемых биологических объектов.

Область применения:

1. Гигиена;

2. Экология;

3. Судебная медицина;

4. Токсикологии;

5. Фармакология;

6. Фармация.

Преимущества:

1. Точное определение родов микроорганизмов.

Недостатки:

1. Недостаточная летучесть биологических объектов;

2. Физико-химическая неустойчивость к воздействиям процессов газовой хроматографии;

3. Не всегда достоверный результат хроматографии в плане определения видов и штаммов микроорганизмов.

Применение жидкостной хроматографии в медицине и биологии.

Жидкостная хроматография, как и газовая, активно развивается в сферах медицины и биологии. Она относится к колончатому типу хроматографии, когда сорбентом заполняют колонку, либо покрывают ее внутренние стенки. В качестве сорбата используют макромолекулы, сорбент представлен нерастворимой решетчатой полимерной матрицей, в углублениях которой происходит удерживание сорбата. Жидкостную хроматографию включают следующие типы хроматографий по взаимоотношению сорбата к сорбенту: эксклюзионная, ионообменная, аффинная, энантиоселективная, молекулярная сорбционная.

Матрицы сорбентов: адсорбента и ионообменника.

Матрица – твердая основа неподвижной фазы, имеющая вид сплошных или пористых гранул.

Модификация матрицы – химическое присоединение ионогенных групп, гидрофобных молекул и биологически активных веществ или фиксация растворителя на поверхность матрицы.

Область применения:	Объект изучения (биологические объекты):
Биология Медицина Фармакология	Кровь Моча Слюна Спиномозговая жидкость Желудочный сок Желчь Миокард Опухоли Печень Мозг

Разновидность жидкостной биохроматографии:	Объекты изучения (химические вещества):
Молекулярно-сорбционная биохроматография	Аминокислоты, сахара, липиды, жирные кислоты, стероиды, простагландины, лекарства, катехоламины, порфирины, нуклеотиды, нуклеозиды, витамины, холестерин.
Эксклюзионная биохроматография	Белки, вирусы, ферменты, полипептиды, пептиды, нуклеиновые кислоты, липопротеины.
Аффинная биохроматография	Биологически активные вещества.
Ионообменная хроматография	Макрокомпоненты крови и желудочного сока Cl-, Na+, K+, HCO3 , Са2+

На ряду с типичной классификацией хроматографии применяют и классификацию по природе подвижной и неподвижной фаз. Специфический для жидкостной хроматографии набор фаз в обращено-фазовой хроматографии подразумевает под собой сильно полярную жидкую фазу и неполярную твердую, при этом сорбат выталкивается плотно укомплектованными из-за сильных Ван-дер-Ваальсовых сил молекулами элюента в сторону (компонент смеси обращается по направлению к сорбенту) поверхности сорбента. Для такого вида анализа применимы слабо или неполяризованные сорбаты. Для нормально-фазовой биохроматографии существует стандартный набор фаз: подвижная слабополярная и неподвижная сильнополярная фазы.

Преимущества:

1. Высокоэффективная колонка

2. Селективность разделения (слабые межмолекулярные взаимодействия определяемого вещества с молекулами жидкого элюента)

3. Возможность анализа термически и химически неустойчивых биологически активных соединений (благоприятные условия хроматографии: низкая температура, инертный растворитель, отсутствие контакта с кислородом и др.)

Недостатки:

1. Денатурация сорбата (белков) приводит к ошибкам анализа (в случае с неблагоприятными условиями проведения хроматографии или расположения сорбата вплотную с поверхностью сорбента, обнаруживающееся при высоком соответствии пространственного расположения сорбционных или ионообменных участков сорбата с таковыми на поверхности сорбента);

2. Недоступность всей рабочей поверхности сорбента для компонентов разделяемой смеси в связи с произвольным размером пор матрицы(с применением нано-технологий эта проблема вполне решаема) (недостаток эксклюзионной хроматографии).

3. Затруднительный подбор неконфликтующих веществ для элюента и сорбента.

Определение карбоновых кислот жидкостной биохроматографией.

Карбоновые кислоты можно определить тремя путями, каждый из которых подходит под разную полярность сорбата. Определение сильнополярных карбоновых кислот осуществляется по ионно-парному пути обращено-фазовой хроматографии. Среднеполярные карбоновые кислоты определяются с использованием силикагеля (сорбат) и уксусной кислоты в элюенте. Но, для большинства определяемых веществ подходит путь хроматографии с алкилсиликагелем и буферных добавок в подвижную фазу.

Аффинная жидкостная биохроматография.

Разделение биологически активных веществ в аффинной хроматографии основано на и специфическом взаимодействии с лигандами (поверхностными компонентами матрицы, связанные с ней ковалентными связями). Удерживание происходит между ферментом и его субстратом. Разнообразие моделей «фермент-субстрат»: фермент-ингибитор, гормон-рецептор, антиген-антитело, полинуклеотид-гибридизированный полинуклеотид.

Взаимодействие лиганда с ферментом (сорбатом) приводит к удалению последнего из раствора. Эффективный контакт происходит при связывании функциональных группы взаимодействующих веществ.

Аффинная хроматография применяется для выделения следующих

классов веществ: аналогов субстратов, ингибиторов, кофакторов (при этом

роль лигандов играют ферменты; антигенов, вирусов, клеток (лиганды –

антитела); полисахаридов, гликопротеинов, клеток (лиганды – лектины);

гистонов, полимераз (лиганды – нуклеиновые кислоты); рецепторов, бел-

ков-переносчиков (гормоны, витамины); белков, специфически взаимодей-

ствующих с мембраной клетки, лектинов (лиганды – клетки).

Объекты анализа: Фермент Гормон Антиген Полинуклеотид Кофакторы Сахариды Гликопротеиды Гистоны Полимеразы Белки-переносчики Клетки Лектины (где клетки – лиганды, а субстрат – фермент)

Область применения: Биология Медицина

Сорбенты аффинной жидкостной биохроматографии.

В данном виде хроматографии сорбенты представляют собой гели на основе агарозы: сефароза 4В, сефароза СL, аффи-гель.

Сефароза 4В – сорбент с крупными внутренними поверхностями пор, доступными и целевому веществу (сорбату) и лигандма, обладающий хорошими гидродинамическими свойствами колонки.

Сефароза CL – сорбент из ковалентно сшитых молекул агарозы, устойчивый в органических растворителях, при повышенной температуре и в присутствии денатурирующих агентов.

Эксклюзионная жидкостной биохроматография.

Эксклюзионная (ситовая) хроматография – метод, основанный на различной способности молекул разного размера проникать в поры нейтрального геля или пористого тела, которые служат неподвижной фазой. Неподвижная фаза в гель-проникающей хроматографии (с использованием геля в качестве сорбента) представлена жидкостью пористых гранул, куда не проникают крупные молекулы элюата, но мелкие такую возможность имеют и адсорбируются. Степень адсорбции в эксклюзионной хроматографии зависит от коэффициента распределения (для крупных не проникающих молекул он равен нулю).

Своеобразная методика позволяет сортировать рабочий раствор, устраняя крупные молекулы, как делают обессоливание растворов полимеров, или наоборот, очищать раствор от микромалекул, например, очистка макромолекул от сопутствующих им низкомолекулярных компонентов. Оставшиеся (способные к адсорбции в любой степени) сорбаты подразделяются на группы в зависимости от формы и размеров, и двигаются с определенной характерной для этой группы скоростью по колонке.

Преимущества:

1. Лабильность методики – регуляция структурной организации сорбента позволяющая переключаться на режим адсорбционного хроматографического анализа;

2. Разделение биологических объектов по размерам и формам;

3. Определение физических свойств белков (в том числе и формы), метод может конкурировать с микроскопическими исследованиями.

Недостатки:

1. Неравномерное распределение сорбата в объеме элюента сказывается на качестве хроматограмм. Они теряют точность, а пики увеличиваются по ширине, делая чтение результатов довольно сложным процессом;

2. Небольшое число разделяемых веществ из-за различий в сопоставлении размера молекулы определяемого вещества и гранулы сорбента.

Применение эксклюзионной жидкостной гель-хроматографии в биологии:

1. Разделение белков вируса

2. Очистка белка от низкомолекулярных компонентов

3. Очистка рибосом

4. Очистка полисом

5. Очистка ферментов, участвующих в синтезе белка (ферментами, образующими комплексы с нуклеиновыми кислотами и их составляющими)

6. Определение степени полимеризации синтетических полимеров

7. Фракционирование субклеточных единиц и вирусов

8. Отделение низкомолекулярных радиоактивных веществ при введении изотопной метки биополимеров

9. Определение констант равновесия (!)