МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Доклад:

Хроматографические методы анализа и их применение в биологии

Выполнил: Студент 1 курса, 2 группы, 2 подгруппы

факультета биологических наук Криволай А.Г.

Проверил: доцент кафедры аналитической химии Горбунова М.О.

Ростов-на-Дону

2013 г.

Введение

Хроматография (от греч. chroma – цвет; от греч. grapho - пишу) – современный физико-химический метод разделения и анализа многокомпонентных смесей, основанный на изучении расхождения веществ между двумя фазами: неподвижной, несмешивающейся с подвижной фазой жидкостью или твердым субстратом, на которой происходит удержание компонентов смеси, и подвижной, жидкостью или газом, являющимися средствами передвижения компонентов вдоль неподвижной фазы. Метод характеризуется высокой точностью оценки количества веществ и широкими возможностями их разделения, удобным и относительно недорогим инструментарием. Возможность автоматизации метода создает для него привилегированный статус в промышленности.

Хроматографию используют для определения катионов щелочных, щелочно-земельных и переходных металлов, неорганических ионов, органический кислот и оснований.

Метод разработал Михаил Семенович Цвет, русский ботаник и физикохимик, исследовавший в 1900-1903 гг. пигменты растений. Пропуская раствор смеси через трубку с порошкообразным карбонатом кальция, он промывал содержимое инструмента растворителем, в результате чего отдельные компоненты смеси разделялись на обособленные группы и образовывали цветные пятна. Получившиеся островки веществ определялись сначала специальными реагентами, а в дальнейшем распознавались по характерной для каждого из них окраске. Метод был назван в честь первооткрывателя. Инновационное решение в аналитической химии тех лет встретилось научным сообществом неоднозначно, метод казался слишком простым и вызывал подозрения в точности определения веществ. Однако с 1931 года он зарекомендовал себя в работах Р. Куна, А. Винтерштейна и Е. Ледерера, которым при помощи хроматографии удалось выделить из сырого каротина α и β фракции в кристаллическом виде, что сильно повысило авторитет и автора и изобретения.

Продвижением разработки Цвета занимались Дж. Мартин и Р. Синг. В 1952 году этим ученым была присуждена Нобелевская премия в области химии за создание метода распределительной хроматографии. В настоящее время среди методов хроматографии большой популярностью пользуются газовая и ионная хроматография. Первый позволяет определять углеводород, органические кислоты, спирты, пестициды, удобрения, витамины, наркотики и другие органические вещества. Второй применяется в промышленности для очистки и выделения лекарственных препаратов.

В биологии применяются газовая, жидкостная эксклюзионная, жидкостная ионообменная, жидкостная адсорбционная, тонкослойная хроматографии и электрофорез.

Цели

1. Кратко ознакомиться с разновидностью физико-химического метода анализа – хроматографией

2. Ознакомиться со всеми методами хроматографического анализа

3. Уделить особое внимание методам, основанным на идентификации и определении количества разделяемых веществ органического типа.

Задачи

1. Не вдаваясь в глубокие подробности принципов хроматографического анализа, сформулировать основные понятия и законы.

2. Дать список методов хроматографического анализа по всем возможным классификациям. Привести краткое описание каждого метода.

3. Детально описать каждый метод хроматографического анализа, применяемого в биологии или медицин, по следующей схеме:

1. Дать определение метода.

2. Сущность метода

3. Преимущества и недостатки метода

4. Указать, в какой области производства метод применяется и что этим методом исследуют.

5. Требования к сорбенту, элюенту.

Знакомство с хроматографией.

Хроматография – метод разделения смесей веществ, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

Инструментарий хроматографии.

Используемые в методе фазы:

• Подвижная фаза - поток жидкости или газа, перемещающий компоненты разделяемой смеси вдоль неподвижной фазы.

• Неподвижная фаза - твердый сорбент или несмешивающаяся с подвижной фазой жидкость, на которых осуществляется различное удерживание и разделение компонентов смеси.

Вещества в качестве фаз выбираются с расчетом их взаимной не смешиваемости.

Вещество неподвижно фазы называют сорбентом. Сорбент – твердое вещество, жидкость или их смеси, способные удерживать газы, пары или растворенные вещества. Сорбенты подразделяют на адсорбенты и абсорбенты.

• Адсорбент – твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества.

• Абсорбент - твердый или жидкий сорбент, растворяющий в своем объеме газы, пары или компоненты жидких смесей.

Твердые вещества, жидкости и газы, они же компоненты разделяемой смеси, именуются сорбатами. Сорбат – компоненты разделяемой смеси, удерживаемое сорбентом. Вещество подвижной фазы называют элюентом. Элюент – жидкость или газ, используемые в качестве подвижной фазы. Элюент вместе с компонентами разделяемой смеси – элюат.

Классификация хроматографических методов анализа.

Критерии классификации:

1. Агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз (жидкость или газ для подвижной фазы; несмешивающаяся жидкость или твердое вещество для неподвижной).

2. Механизмы взаимодействия сорбента и сорбата (механизмы удержания компонентов разделяемой смеси неподвижной фазой).

3. Техника хроматографического анализа.

4. Способ перемещения фаз.

5. Цель хроматографирования.

Классификация (I) по агрегатному состоянию фаз:

1. Газовая хроматография (газожидкостная, газотвердофазная и газомезофазная).

2. Жидкостная хроматография (жидкостно-жидкостная, жидкостно-твердофазная и жидкостно-гелевая).

В данной классификации в сложном названии хроматографии первое слово обозначает агрегатное состояние подвижной фазы, второе – неподвижной фазы.

Классификация (II) по механизмам взаимодействия сорбента и сорбата:

1. Распределительная хроматография. Метод, основанный на различии растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе. Частным случаем метода является жидкостно-жидкостная хроматография, где растворимость веществ сравнивают и в неподвижной, и в подвижной фазах.

2. Ионообменная хроматография. Метод, основанный на различии предрасположенности веществ к ионному обмену.

3. Адсорбирующая хроматография. Метод основан на различии степени адсорбируемости веществ твердым адсорбентом.

4. Эксклюзионная хроматография. Метод основан на различии в размерах и строении молекул разделяемых веществ. В качестве неподвижной фазы используют гель или пористую сетчатую конструкцию. Метод работает по принципу: меньше молекула – доступнее поры – больше степени адсорбции – меньше скорость движения.

5. Аффинная хроматография или биоспецифическая. Биологический метод, основанный на специфических взаимодействиях биологических объектов. Примеры: фермент – ингибитор, гормон – рецептор, антитело – антиген.

6. Лигандная хроматография. Метод основан на разделении веществ, способных образовывать комплексы с поглощенными на катионите ионами металлов (катионит - ионообменный материал, который способен обменивать свои положительно заряженные ионы на положительно заряженные ионы, содержащиеся в окружающей среде).

7. Осадочная хроматография. Метод основан на различии произведений растворимости осадков разделяемый веществ с сорбентом.

8. Адсорбционно-комплексообразовательная хроматография. Метод основан на образовании комплексных соединений различной устойчивости в неподвижной фазе или на поверхности сорбента.

Классификация (III) по технике выполнения хроматографии:

1. Колончатая хроматография – метод, включающий в себя насадочную и капиллярную хроматографию. В первом случае колонка хроматографа заполняется зерненым сорбентом, во втором - сорбент наносится на внутренние стенки капилляра.

2. Плоскостная хроматография – метод широкого применения, содержит используемую в образовательных целях бумажную хроматографию (разновидность распределительной), тонкослойную – весь спектр хроматографий.

Классификация (IV) по способу перемещения фаз:

1. Проявительная хроматография. Метод, в котором компоненты разделяемой смеси конкурируют друг с другом по скорости распределения вдоль сорбента от влияния элюента в газовом агрегатном состоянии.

2. Фронтальная хроматография. Метод, основанный на непрерывном пропускании анализируемой смеси через слой сорбента.

3. Вытеснительная хроматография. Метод с применением сильно сорбирующихся веществ.

Фронтальный метод применяется в хроматографах гораздо реже, чем проявительный по той причине, что он позволяет выделить из смеси в чистом виде лишь одно, наиболее слабо сорбирующееся вещество. Данный метод используется в хроматографах для аналитических и препаративных целей только в особых случаях. Фронтальный метод применяется также для определения физико-химических характеристик вещества, в частности, для определения изотерм сорбции.

Классификация (V) по целям хроматографического анализа:

1. Аналитическая хроматография (идентификация веществ).

2. Препаративная хроматография (получение веществ в чистом виде).

3. Промышленная хроматография (автоматизированный метод, основанный на подаче продукта анализа на электронный датчик).