Лабораторная диагностика

Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфониевая кислота, которая реагирует со связанным билирубином и дает красное окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает красное окрашиваниераствора. По интенсивности последнего определяют концентрацию общего билирубина. Свободный билирубин равен разнице между общим и связанным.

Ход определения. В три пробирки (для определения уровня общего билирубина, связанной фракции и постановки контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме (табл.2.).

Таблица 1

Данные для определения уровня билирубина в сыворотке крови

Реактив, мл	Общий билирубин	Конъюгированный билирубин	Контрольная проба
Сыворотка	0,25	0,25	0,25
Кофеиновый реактив	1,75	-	1,75
Физиологический раствор	-	1,75	0,25
Диазосмесь	0,25	0,25	-

Колориметрируют пробы при зеленом светофильтре (500-560 нм); применяют кювету с шириной слоя 5 мм. Оценку результатов проводят по калибровочному графику, построенному в соответствии с инструкцией к наборам реагентов «Билирубин – эталон» фирмы «Лахема».

Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня свободной фракции из цифр общего билирубина вычитают показатель конъюгированного.

В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л. 75% его количества приходится на долю свободной фракции.

Средние величины содержания в плазме общего, конъюгированного и свободного билирубина составляют соответственно 11,12; 2,57 и 8,56 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение исследования пигментного обмена

Желтуха (гипербилирубинемия) – важный симптом нарушения пигментного обмена. Обычно проявляется клинически при уровне билирубина в крови 27-34 мкмоль/л. Тяжесть желтухи соответствует величинам билирубинемии. Так, принято считать, что её лёгкая форма соответствует цифрам билирубина до 85 мкмоль/л; уровень его 86-169 мкмоль/л свидетельствует о среднетяжёлой, а свыше 170 мкмоль/л – тяжёлой форме.

Выделяют три основные причины гипербилирубинемий, которые обусловливают три формы желтух: 1) усиление гемолиза эритроцитов; 2) нарушение функции печёночных клеток; 3) задержка оттока жёлчи.

Гемолитические желтухи делятся: 1) врождённые – Rh-конфликтная беременность; 2) наследственные: а) нарушение структуры мембраны эритроцита – наследственный микросфероцитоз; б) нарушение обмена Нb – физиологическая желтуха новорождённых; в) блоки ферментов гликолиза и АРЗ в эритроците – недостаточность энзима глюкозо-6-фосфатазы; а также талассемии, порфирии, гемоглобинозы; 3) приобретённые – отравление уксусной кислотой, сульфаниламидами, инфекции (грипп, сепсис, пневмония), малярия, ожоговая болезнь, «маршевый» гемолиз, переливание несовместимой группы крови, аутоиммунные гемолитические анемии.

В крови – гипербилирубинемия за счёт свободной фракции (103-171 мкмоль/л); снижено содержание эритроцитов; увеличено количество ретикулоцитов (усилена регенерация эритроцитов в периферической крови); изменение формы эритроцитов (макроцитоз, микросфероцитоз, овалоцитоз). Тёмная окраска кала и мочи за счёт повышенного содержания l-уробилина. Желтушность кожи и склер умеренная, кожные покровы обычно бледные (за счёт анемии); функции печени существенно не страдают.

Паренхиматозные желтухи выделяют: 1) ???наследственные: а) синдром Жильбера – доброкачественное заболевание, в основе которого лежит энзим-ный дефект переноса свободного билирубина через мембрану гепатоцита; в крови – гипербилирубинемия за счёт свободной фракции; б) синдром Криглера-Найяра (прогноз неблагоприятный) развивается при отсутствии в печёночных клетках УДФ-глюкуронилтрансферазы, что приводит к глубоким нарушениям обезвреживающей функции печени; в крови – гипербилирубинемия за счёт свободного билирубина; у детей, возможно развитие «ядерной» жёлтухи с клиникой энцефалопатии и летальным исходом; в) синдром Дабина-Джонсона-Ротора связан с энзимным дефектом в транспортной системе, а именно, нарушено выведение связанного билирубина из гепатоцита и он поступает в кровь; в крови – гипербилирубинемия за счёт связанного билирубина.

Приобретённые паренхиматозные желтухи возникают в результате деструктивно-дистрофических изменений в печени или инфильтративных - в строме (острые вирусные, инфекционные и токсические гепатиты, хронический гепатит, болезнь Вильсона). Застою билирубина способствует резкое ослабление метаболических процессов в печени. Повышение содержания общего и, в особенности, связанного билирубина в крови, а также наличие последнего в моче не являются ранними признаками поражения паренхимы печени. Поэтому диагностическое значение этих показателей невелико. Большую роль они играют в прогностическом плане: по мере затухания патологического процесса уровень билирубина в крови снижается. Наиболее «чувствительный» признак поражения печени при гепатитах служит появление уробилиногена в моче, которое наблюдается ещё в дожелтушный период. В период разгара паренхиматозного гепатита происходит исчезновение уробилина, так как стаз жёлчи приводит к уменьшению выведению билирубина; в период восстановления гепатоцитов жёлчь выделяется в большем количестве и вновь появившаяся уробилинурия является благоприятным прогностическим признаком. Длительная уробилинурия, сопровождающаяся другими клиническими и биохимическими признаками патологии, рассматривается как неблагоприятный исход заболевания.

Обтурационные (механические) желтухи делятся на врождённые и приобретённые. Первые - вызваны атрезией или гипоплазией жёлчных хо-дов. Вторые – обусловлены внутри- или внепечёночным холестазом, что приводит к уменьшению или прекращению поступления жёлчи в кишечник. Внутрипечёночный холестаз возникает при эстрогенной терапии у женщин; у некоторых – во время беременности; при первичном и вторичном билиарном циррозе печени, при новообразованиях печени. В крови: гипербилирубинемия за счет связанной фракции; повышена активность ЩФ при нормальных цифрах трансаминаз; очёнь высок уровень жёлчных кислот; в моче – связанный билирубин.

Внепечёночный холестаз может быть вызван жёлчнокаменной болезнью, острым панкреатитом, раком головки поджелудочной железы, раком Фатерова сосочка. В крови на фоне гипербилирубинемии за счет связанной фракции отмечается резкая активность трансаминаз и щелочной фосфатазы. Моча тёмная, пенится за счёт наличия связанного билирубина и жёлчных кислот; кал обесцвечен, жирный, глинистый из-за отсутствия стеркобилина и нарушения всасывания продуктов распада липидов и липовитаминов (жёлчь не поступает в кишечник).