Векторные системы на основе Тi-плазмид

Самый простой способ использования природной способности Тi-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя нуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Тi-плазмид и Agrobacterium tumefaciens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то‚ что Тi-плазмиды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования.

- Фитогормоны, синтезируемые трансформированными клетками в культуре, подавляют регенерацию из этих клеток зрелого растения, поэтому при конструировании векторов на основе Тi-плазмиды гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.

- Ген опина несуществен для трансгенных растений, но при его наличии может снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опина. Следовательно, при создании векторов ген опина также должен быть удален.

- Тi-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

- Тi-плазмиды не реплицируются в Еscherichia coli, что исключает работу с рекомбинантными Тi-плазмидами в этих бактериях. Следовательно, при конструировании векторов на основе Тi-плазмид необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их поддержание в Еscherichia coli.

Несмотря на все эти сложности, было сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Тi-плазмид организованы сходным образом и имеют следующие элементы.

- Селективный маркерный ген, например ген неомицинфосфотрансферазы, который обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину (антибиотику). Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала терминации-полиаденилирования. Это обеспечит эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках.

- Сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Еscherichia coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации Agrobacterium tumefaciens.

- Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности.

- Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Поскольку клонирующие векторы не содержат генов vir, они сами не способны обеспечивать транспорт и интеграцию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработаны определенные подходы. Например‚ бинарная векторная система – двухплазмидная система Agrobacterium‚ предназначенная для переноса участка Т-ДНК‚ несущего клонированные гены‚ в растительные клетки. Гены вирулентности локализованы на одной плазмиде‚ а встроенный участок Т-ДНК – на другой.