3. Современные методы картирования геномов

Задача 1) определить относительное расположение каких-то определенных участков хромосом

Задача2) отпределить расстояние между ними

Картирование геномов

• Генетическое

• Физическое

• Цитологическое

Генетические маркеры

• Ген (фенотипический маркер)

• R FLP

• SSLP молекулярные маркеры

• SNP

• Ген ( фенотипический маркер) – используются такие гены, инактивация которых имеет фенотипическое проявление ( проявление генотипа в фенотип).

Полиморфизм – это аллели конкретного участка ДНК. Как правило, это либо нуклеотидная замена, либо небольшая инсерция или делеция.

• RFLP ( полиморфизм длин рестрикиционных фрагментов) –это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикций ( расщепляют нукл. К-ты в середине ) и дальнейший анализ образовавшихся фрагментов ( рестриктов) путем гель-электрофореза

SSLP ( полиморфизм длин простых повторов)- Их есть 2 типа: минисателлиты и микросателлиты. Микросателлиты – повтор 2,3,4 н.п. Это ошибки в работе ДНК-полимеразы. Когда есть участок, где много раз повторяется олигонуклеотид, есть вероятность проскальзывания ДНК-полимеразы. Она с определенной долей вероятности может диссоциировать с матрицей и присоединиться к соседнему повтору. В результате при репликации будет либо на один повтор больше, либо на один меньше. С минисателлитами (это повторы до 25 н.п.) не совсем понятно, каким образом они генерируются. Одна из моделей предполагает, что они таким же образом получаются.

• SNP (Полиморфизм по одиночным нуклеотидам) – отличия последовательности ДНК размеров в 1 нуклеотид в геноме представителя одного вида

Детекция молекулярных маркеров

1. Гибридизация ДНК

2. Полимеразная цепная реакция

Недостатки генетического картирования

1. Ограниченная разрешающая способность

2. Ограниченная аккуратность из-за неравномерности кроссинговера и экспериментальных ошибок

Основные методы физического картирования

1. Рестрикционное картирование

2. FISH (флуорисцентная гибридизация in situ)

3. Картирование STS-маркеров

Особенности рестрикционного картирования крупных молекул ДНК

1. Использование рестриктаз, распознающих 7 или 8 нуклеотидов

2. Использование рестриктаз, в сайт распознавания которых входят редкие комбинации нуклеотидов

3. Использование специальных методик гель-электрофореза с переменным электрическим полем для разделения крупных до 2 мб фрагментов ДНК.

FISH ( флуоресцентная гибридизация) - Методика флюоресцентной гибридизации на препаратах позволяет непосредственно локализовать на хромосомной карте интересующий Вас локус.

Модификации FISH

Главный недостаток FISH – низкое разрешение до 1 мб

Модификации:

• Механически растянутые хромосомы (разрешение до 200-300 кб, индивидуальные хромосомы распознаваемы)

• Неметафазные хромосомы (разрешение до 25 кб, индивидуальные хромосомы распознать нельзя)

• Fiber-FISH: FISH на препаратах ДНК, подготовленных путём растягивания в геле или «молекулярного причёсывания». Разрешение 10 кб и лучше.

STS-картирование

Современная альтернатива генетическому картированию.

Критерием расстояния между маркерами служит не частота рекомбинации, а частота разрывов ДНК между соседними маркерами при фрагментации генома при построении геномных библиотек.

Для STS-картирования нужны:

• STS-маркеры(короткие фрагменты ДНК длиной 100-500 п.н.)

• Набор многократно перекрывающихся фрагментов ДНК

Критерии отбора STS-маркеров:

• Последовательность ДНК 100-500 п.н.

• Эта последовательность должна встречаться в геноме 1 раз

Источники STS-маркеров:

• EST

• SSLP

• Случайные геномные последовательности

Набор фрагментов ДНК для картирования

1. Стандартная клонотека

2. Набор клеток радиационных гибридов

При построении карты генома методом картирования одну клонотеку можно использовать и для картирования, и для последующего секвенирования.

(Прочитать со станицы 11 лекции по геномике)