- •Курсовая работа по дисциплине «Микробиологические методы контроля»
- •Минск 2013 Реферат
- •Содержание
- •Введение
- •1 Основная часть
- •1.1 Характеристика потерь сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов от микробиологической порчи
- •1.1.1 Уровень загрязненности сельскохозяйственного сырья и пищевой продукции микроорганизмами
- •1.1.2 Потери сельскохозяйственной продукции в процессе хранения
- •1.1.3 Способы защиты продукции от микробиологической порчи
- •1.2 Микробиологическая безопасность пищевых продуктов и ее характеристика
- •1.2.1 Показатели микробиологической безопасности пищевых продуктов
- •1.2.2 Требования нормативной документации к микробиологической безопасности продукции
- •1.2.3 Способы повышения микробиологической безопасности пищевых продуктов
- •1.3 Клетки микроорганизмов и их лизис
- •1.3.1 Строение клеточных стенок бактерий
- •1.3.2 Лизис клеточных стенок бактерий с сохранением и подавлением жизнеспособности клеток
- •1. Гомогенизация
- •2. Растирание клеток
- •3. Обработка ультразвуком
- •4. Френч-прессование
- •5. Ферментативный лизис клеток
- •1.3.3 Строение клеточных стенок гриба и их разрушение
- •1.4 Протопласты микроорганизмов
- •1.4.1 Методы получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода
- •1.4.2 Свойства протопластов микроорганизмов
- •1.4.3 Методы слияния протопластов клеток
- •1.4.4 Ревертация протопластов к клеточным формам
- •2 Экспериментальная часть
- •2.1 Материалы и оборудование
- •2.1.1 Микроорганизмы и питательные среды для культивирования микроорганизмов
- •2.1.2 Выделение чистых культур микроорганизмов, устойчивых и чувствительных к тяжелым металлам
- •2.2 Методы анализа
- •2.2.2 Метод получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода
- •2.2.3 Метод регенерации протопластов и оценка выхода регенерантов
- •2.2.4 Характеристика жизнеспособности протопластов и клеток редуктазным методом
- •2.2.5 Характеристика ростовой активности микроорганизмов
- •2.2.6 Определение тяжелых металлов методом комплексонометрии
- •2.2.7 Определение сорбции тяжелых металлов микроорганизмами
- •2.3 Результаты и их обсуждение
- •2.3.1 Получение устойчивых и адаптированных форм микроорганизмов к тяжелым металлам
- •2.3.3 Характеристика сорбции тяжелых металлов протопластами и клетками микроорганизмов
- •Заключение
- •Список использованной литературы
3. Обработка ультразвуком
Ультразвук разрушает микроорганизмы в результате создания высокой степени вибрации и вследствие этого происходит механический разрыв клеток. Для достижения максимального эффекта необходимо применять высокую мощность излучателя и тщательно настраивать его в резонанс с пробой. Следует контролировать уровень пенообразования и перемешивания при обработке, поскольку интенсивное пенообразование приводит к денатурации белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жидкость/газ. Внутренние структуры клеток при этом также подвержены разрушению, что служит классификационным признаком методов, приводящих к утрате жизнеспособности клетки.
Время облучения варьируют от 2 до 15 мин, однако интервалы непрерывной работы обычно не превышают 30 с. В перерывах между разрушениями пробу и излучатель охлаждают ледяной водой. Степень и полноту разрушения контролируют микроскопированием протопластируемой суспензии. За одну обработку можно разрушить примерно 1 г сухой биомассы.
Описанным методом можно разрушать как многие грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, но клетки актиномицетов, дрожжей и других грибов таким методом разрушаются с трудом. Иногда для усиления эффекта ультразвуковой обработки к суспензиям клеток добавляют кварцевый песок, стеклянные бусы малого диаметра или пудру окиси алюминия.
4. Френч-прессование
Ячейка Френч-пресса (Френч-пресс) предназначена для разрушения микроорганизмов, основанного на перепаде давления в пробе от высокого (550-1400 атм) к атмосферному. Быстрое изменение давления взрывает клетки изнутри и таким образом разрушает их. Метод наиболее применим к суспензиям объемами от 10 до 30 мл; разрушение меньших объемов сложно технически, а больших ― занимает много времени. Время, требуемое для разрушения одной порции клеток небольшого объема, обычно не превышает 10—15 мин. В перерывах необходимо тщательно промывать ячейку от предыдущей пробы и постоянно контролировать состояние полиэтиленового шарика, регулирующего на ячейке степень перепада давления. Френч-прессование приводит к подавлению жизнеспособности микроорганизмов.
5. Ферментативный лизис клеток
Разрушение (лизис) клеточных стенок с применением детергентов и ферментов проводят обычно с небольшими порциями биомассы, причем эти методы дают более стандартную обработку для каждой клетки в суспензии, так как концентрации детергентов и ферментов практически одинаковы в любой порции пробы. Как правило, время ферментативного лизиса не превышает 15—30 мин.При разрушении целостных клеток с помощью ферментов микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность.
Выделение протопластов технически — хорошо отработанная процедура, достаточно легко выполняемая. Однако получить жизнеспособные протопласты непросто. Это зависит от многих факторов — состава ферментов, их качества, рН среды и выбора осмотического раствора. Большое значение имеет физиологическое состояние клеточного материала, его возраст, условия выращивания. Факторы, которые активируют рост биомассы, будут увеличивать вероятность получения жизнеспособных протопластов. Для получения протопластов из суспензионных и клеточных культур наилучшей является поздняя стадия логарифмической фазы роста. В этот период клеточные стенки легче всего поддаются энзиматическому разрушению, а протопласты — наиболее жизнеспособны.