2 Экспериментальная часть

2.1 Материалы и оборудование

Для проведения экспериментальной части данной курсовой работы были использованы следующие оборудование и материалы:

– стерильные пипетки;

– бумажные фильтры;

– стерильные чашки Петри;

– спиртовая горелка;

– спирт;

– спички;

– бактериальная петля;

– штатив для пробирок;

– суховоздушный термостат на 50 ºС;

– шпатели металлические;

– бумажные фильтры;

– стерильные пробирки;

– весы лабораторные;

– штатив-скашиватель;

– цилиндр мерный;

– дистиллированная вода;

–питательные среды для микроорганизмов (питательный агар, физиологический раствор, питательный бульон);

– культура микроорганизмов E. Coli;

– культура микроорганизмов Bacillus subtilis;

– соль СuCl₂·6H₂O;

– фотокалориметр и набор кювет.

Для обеспечения стерильности и правильности проведения эксперимента инструменты и питательные среды были предварительно простерилизованы в автоклаве.

2.1.1 Микроорганизмы и питательные среды для культивирования микроорганизмов

В качестве исследуемых микроорганизмов использовали:

1) Bacillus subtilis (сенная палочка) ― грамположительная спорообразующая аэробная почвенная бактерия. Не обладает патогенностью. Форма палочковидная, размер (3-5)×0,6 мкм. Колонии сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, бесцветные или розовые. Край колонии волнистый.

2) Escherichia coli (кишечная палочка) ― грамотрицательнаяне образующая спор анаэробная бактерия, широко встречающаяся в нижней части кишечника теплокровных животных, некоторые штаммы которой являются патогенными. Клетки палочковидные, со слегка закруглёнными концами, размером (0,4-0,8)×(1-3) мкм.

В ходе работы используется физиологический раствор, который имеет следующий состав: хлористый натрий – 8,5 г, дистиллированная вода – 1 дм³. Приготовление: в 1 дм³ дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор в чистые пробирки по 100 см³ и стерилизуют при (121±2)ºС в течение 20±1 мин.

Для культивирования исследуемых микроорганизмов в качестве твердой среды использовался питательный агар. Последовательность приготовления среды следующая:

1) навеску агара массой 11,7 г и навеску микробиологического агара массой 0,9г растворить поместить в мерную посуду для хранения питательной среды и довести дистиллированной водой до метки 300 мл, тщательно взболтать;

2) закрыть специальной крышкой из фольги горлышко емкости и отправить приготовленный раствор на стерилизацию;

3) по мере необходимости застывший агар плавят (90°С), охлаждают на водяной бане до 50°С, заливают в стерильные чашки Петри, ждут застывания и засевают необходимой микробиологической культурой.

Для культивирования микроорганизмов в качестве жидкой питательной среды использовался питательный бульон, приготовление которого включало следующие операции: в 500 см³дистиллированной воды растворяли 20 г пасты рыбного концентрированного гидролизата, доводили до кипения, после остывания фильтровали и доводили рН до 7,2.

2.1.2 Выделение чистых культур микроорганизмов, устойчивых и чувствительных к тяжелым металлам

В качестве чистых культур использовались популяция E. coli и Bacillus subtilis, взятые из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии.

Адаптацию микроорганизмов к тяжелым металлам проводили следующим образом:

1) микроорганизмы были засеяны бактериологической петлей в конденсационную воду скошенной агаризованной питательной среды в пробирках;

2) посевы инкубировались при 37ºС в течение 3суток, после чего выросшие микроорганизмы переносилась в другую пробирку при помощи смыва физиологическим раствором;

3) накопительные культуры из физиологического раствора высевались на поверхность агаризованной питательной среды для получения изолированных колоний;

4) суспензия рассеивалась шпателем для механического разобщения клеток и инкубировалась при 37ºС в течение 1суток;

5) определялась максимальная концентрация соли меди, при которой микроорганизмы выживали (было приготовлено всего три раствора соли СuCl₂концентрациями0,1М, 0,01М, 0,001М);

6) после определения максимальной концентрации соли меди, которую выдерживали исследуемые микроорганизмы Bacillus subtilisи E. coli, культуры отбиралась из чашек Петри и засевались в жидкую питательную среду (питательный бульон) с повышением концентрации соли меди в пределах порядка.

По результатам проведенного эксперимента были построены зависимости, отображающие зависимость количества жизнеспособных клеток от концентрации раствора соли, приливаемого к микробной суспензии.

Рисунок 4 – Зависимость концентрации жизнеспособных клеток Bacillus subtilis от концентрации приливаемой соли

Рисунок 5 - Зависимость концентрации жизнеспособных клеток E. coli от концентрации приливаемой соли