§ 6. Микробиологические основы генной инженерии и биотехнология.
Генетическая карта – это графическое изображение установленной локализации генов в кольцевой молекуле хромосомы, выражен-ное в минутах. Процесс определения локализации генов называется картированием. При картировании используются методы конъюгации,трансдукции и трансформации, позволяющие установить последовательность генов в хромосоме. При конъюгации время переноса всей хро-мосомы, например, у кишечной палочки, составляет 100 минут. Разрушая конъюгативный мостик, образующийся между донором и реципи-ентом, процесс конъюгации можно прервать в любое время. Разница во времени передачи генов от донора к реципиенту служит мерой рас-стояния между генами. Локализацию генов на хромосоме определяют в минутах. Положение гена thr (треониновый оперон) условно принятоза начало отсчёта (0 минут). При конъюгации, идущей с постоянной скоростью передачи ДНК, в течение 1 минуты передаётся около 40 генов, что соответствует 40000 пар нуклеотидов. Последующее сравнительное изучение морфологии и метаболической активности доноров и реци-пиентов позволяет установить у них отсутствие или наличие тех или иных генов. Зная время прерывания конъюгации, определяют локализа-ция данных генов в хромосоме. Генетическим картированием установлено, что гены в бактериальной хромосоме расположены дискретно, то есть друг за другом.
Рестрикционная карта – это графическое изображение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Изучение последователь-ностей нуклеотидов в генах проводят с помощью особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), которые расщепляют ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей. Известно более 100 рестриктаз, каждая из которых распознаёт в ДНК специ-фическую последовательность в 4-6 нуклеотидов. Образовавшиеся после действия рестриктаз отрезки ДНК выделяют и клонируют – раз-множают путём введения фрагмента ДНК в самореплицирующуюся структуру (плазмида, вирус), которыми в последующем инфицируют культуру бактерий. Затем из накопленных гибридных плазмид или вирусов исходные фрагменты ДНК вырезаются рестриктазами и подвер-гаются секвестрированию. Суть секвестрирования состоит в одновременном разрезании специфическими агентами 4 образцов одной и той же ДНК по каждому из 4 оснований (А, Т, Ц и Г) с последующим разделением образовавшихся фрагментов в геле. При помощи этой методики удалось определить полную последовательность нуклеотидов многих генов.
7 из 7
Создание генетических и рестрикционных карт у разных организмов от вирусов до человека позволило подготовить теоретическую и методическую базу, на которой возникла генная инженерия.
Генная инженерия – это новое направление генетики, являющееся одним из разделов биотехнологии. Объектом исследования ген-ной инженерии служат гены и операции с ними, а целью исследования является пересадка генов в гетерогенные системы и их экспрессия для получения кодируемых генами белков-гормонов, ферментов, антигенов и других биологически активных веществ. Реципиентами генов яв-ляются преимущественно бактерии или дрожжевые грибы, культивирование которых позволяет получать генные продукты в промышленных масштабах.
Все операции с генами при генной инженерии выполняются с помощью различных ферментов: рестриктаз, лигаз, транскриптаз. Ре-стриктазы (или эндодезоксирибонуклеазы) расщепляют молекулы ДНК в строго определенных участках нуклеотидной последовательности. Существует множество рестриктаз, узнающих любую последовательность нуклеотидов. Ковалентное сшивание нитей ДНК осуществляет ДНК-лигаза, тогда как копирование фрагментов ДНК выполняют транскриптазы. С помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза)становится возможным образование ДНК по матрице иРНК.
Для переноса вырезанного гена из одного генома в другой используютсявекторы – молекулы ДНК, способные к автономной репли-кации и транспортировке чужеродной генетической информации в клетку. В качестве векторов используют бактериальные плазмиды, ДНК- и РНК-вирусы, а также касмиды – производные плазмид и вирусов.
Для генно-инженерного конструирования геномов нередко используются дополнительные генетические элементы – линкеры (link -связь), спейсеры (space - пространство), промоторы (promote - продвигать),кодоны. Линкеры – это олигонуклеотиды, предназначенные для восстановления рамки считывания генетического кода при ее сдвиге. Спейсеры – олигонуклеотиды, при помощи которых проводят отделе-ние от гена слишком близко расположенного промотора. В случаях утраты транслоцируемым геном инициирующего кодона АУГ, его кова-лентно соединяют с началом гена посредством лигаз. Для активного функционирования генов к их началу присоединяют сильно действую-щий промотор; либо ген многократно повторяют, встраивая каждую копию линейно друг за другом (тандемная амплификация).
Процесс создания нового генно-инженерного генома включает несколько этапов. 1. Вырезание нужного гена из генома эукариотиче-ской клетки посредством рестриктаз. 2. Получение копии гена в виде зрелой иРНК, состоящей из одних экзонов. 3. Получение ДНК-копии иРНК с помощью обратной транскриптазы. 4. Внесение рекомбинантной ДНК-копии в состав вектора с помощью рестриктаз и лигаз. 5. Вне-сение вектора в геном бактериальных или грибковых клеток с последующим их культивированием. 6. Отбор колоний реципиентов, в которыхтрансфецированный ген проявил себя наиболее полно. 7. Проверка наличия вставленного гена методами молекулярной гибридизации и ре-стрикционного анализа.
В настоящее время методом генной инженерии получены некоторые лекарственные препараты (интерфероны, инсулины) и антигены,используемые в качестве вакцин.
Биотехнология (от греч. bios – жизнь,tecen – искусство, logos – наука) – это область знаний, которая на основе изучения биологиче-ских процессов, протекающих в живых организмах и системах, использует эти процессы, а также сами биологические объекты (вирусы, бак-терии, грибы, растительные и животные клетки) для получения в промышленных условиях необходимых ценных для человека продуктов или создания процессов и материалов, ранее не встречавшихся в природе. В зависимости от решаемых задач биотехнология подразделяется намедицинскую, сельскохозяйственную и экологическую. Медицинская биотехнология решает следующие задачи:
1. Создание и производство лечебных, профилактических и диагностических препаратов (антибиотиков, интерферонов, гормонов, ви-таминов, вакцин, антител, антигенов, иммуномодуляторов и др.).
2. Разработка и практическое использование материалов, приборов, аппаратуры, восполняющих дефекты в работе отдельных органов и тканей (искусственные коже, сердце, почки и др.).
3. Разработка на основе знаний о геноме человека проблем генодиагностики, генотерапии и генопрофилактики наследственных и дру-гих заболеваний путём пересадки генов.
4. Создание принципиально новых методов для проведения лабораторных и клинических анализов с помощью биосенсоров, реги-стрирующих физические, химические и биологические эффекты взаимодействия биореагентов (например, ферментов, антител, антигенов) с клетками или молекулами-мишенями.
Сельскохозяйственная биотехнологиязанимается проблемами повышения урожайности, продуктивности животноводства путём выведения с помощью генной инженерии новых трансгенных сортов растений и пород животных. Экологическая биотехнология разраба-тывает биологические системы деградации и обезвреживания вредных химических веществ, загрязняющих окружающую среду.
Биотехнология использует такие технологические принципы и процессы, как брожение (ферментация); биоконверсия (превращение одного вещества в другое); культивирование микроорганизмов, растительных и животных клеток; генная инженерия. Основными объектами биотехнологии являются микроорганизмы, поскольку их можно выращивать в промышленных объёмах в короткие сроки на недефицитных питательных средах и по сравнительно простой технологии. Кроме этого, большинство химически сложных веществ, получаемых из микро-организмов, пока недоступны для синтеза другими способами, а также для микробиологической промышленности не требуется сложной ап-паратуры и в ней, в основном, применима аппаратура, используемая в химической промышленности. Многие микроорганизмы (бактерии, ви-русы, грибы) обладают высокой синтетической способностью, интенсивным ростом и накоплением целевого продукта, а также безопасно-стью и безвредностью при массовом культивировании в производственных условиях. Микроорганизмы являются реципиентами генов целе-вых продуктов для получения рекомбинантных штаммов, продуцирующих интерфероны, гормоны, витамины, антибиотики и пр.
Производство биотехнологической продукции включает следующие основные этапы: (1) культивирование микроорганизмов; (2) вы-деление, концентрация и очистка целевого продукта (микробной массы, ферментов, антибиотиков и др.); (3) приготовление, стандартизация иконтроль готового целевого продукта.
Биотехнология решает основные проблемы жизнеобеспечения человека и в ближайшие десятилетия будет определять уровень науч-но-технического прогресса всего человечества.
