Биохимия пособие Коновалова 2012

ду тимидина и аденина бактерии могут обходиться без тетрагидрофо­ лата.

14. В конце 19-го и в тридцатые годы 20-го столетия в сельских местностях на юге США, а в годы Великой Отечественной войны на Кавказе было широко распространено заболевание, признаками кото­ рого являлись симметричные пигментированные высыпания на лице, шее, тыльной поверхности рук, дерматит, рвота или диаррея, отечность и воспаление языка, бессонница, эйфория,'галлюцинации, даже слабо­ умие. Население этих местностей употребляло в пищу мало мяса, мо­ лочных продуктов, а в основном питалось кукурузой. Назовите это за­ болевание. Объясните причину его возникновения и почему такое пи­ тание приводило к нему.

Ответ: Заболевание пеллагра связано с недостаточным поступ­ лением витамина РР - никотиновой кислоты. Витамин РР может син­ тезироваться в организме из триптофана (незаменимой аминокисло­ ты). При белковой недостаточности и при питании кукурузой, в кото­ рой отсутствует триптофан, нарушается синтез никотиновой кислоты и развивается авитаминоз РР. В самой кукурузе никотинамид содер­ жится в больших количествах, но он находится в'связанной форме, которая не усваивается организмом. Известно, что если обработать кукурузу слабо щелочным раствором (известковой водой), никотина­ мид высвобождается и может всасываться в кишечнике.

15. Витамины А и'Д можно применять однократно в дозе, обес­ печивающей их нормальное содержание в организме в последующие несколько недель. Витамины группы В (Вь В2, РР, В6 и др.) необходи­ мо получать ежедневно. С чем это связано?

Ответ: Витамины А и Д депонируются в организме, а водорас­ творимые витамины группы В быстро выводятся из организма.

типе желтухи, какие дополнительные исследования нужно назначить, чтобы подтвердить Ваше предположение.

Ответ: Паренхиматозная желтуха. Дополнительно необходимо назначить исследование желчных пигментов мочи и кала. В моче должны определяться билирубин, уробилиноген. Стеркобилиноген в кале —норма.

2. Получены результаты обследования больного: Анализ крови:

631

общий билирубин 50 мкмоль/л, прямой билирубин 5,1 мкмоль/л. Ана­ лиз мочи: билирубин (-), уробилиноген (+++). Анализ кала: стеркобилиноген выше нормы. Ваше заключение.

Ответ: Гемолитическая желтуха.

3.Результаты обследования больного анализ крови: общий би­ лирубин 30 мкмоль/л, прямой билирубин 20 мкмоль/л. Анализ мочи: билирубин (+), уробилиноген (—). Анализ кала: стеркобилиноген резко снижен. Ваше заключение.

Ответ: Обтурационная желтуха.

4.Некоторые мутации гена гемоглобина оказывают влияние на синтез всех трех типов гемоглобина - Аь А2 и F, тогда как другие - только на один из них. Почему?

Ответ: Мутации гена a -цепей влияют на все три вида гемогло­ бина, поскольку эти гемоглобины имеют соответственно следующее субъединичное строение а2р2 сс282 а2у2. Мутации генов р-, 5- и у- цепей скажутся только на одном из типов гемоглобина.

5. При изучении транспорта кислорода у беременных было пока­ зано, что кривые насыщения гемоглобина в крови матери и плода, по­ лученные в одних и тех же условиях, сильно различаются.

а) Какой гемоглобин обладает при физиологических условиях более высоким сродством к кислороду? Какое физиологическое зна­ чение имеет тот факт, что два гемоглобина обладают разным сродст­ вом к кислороду?

Ответ: a) Hb F, то есть гемоглобин плода, б) Hb F забирает 0 2 от

НЬ А матери.

% насыщения 0 2

6. Единичная молекула ДНК в хромосоме E.coli (м.м

2800000000) содержит около 4,5 млн. мононуклеотидов. Высота каж­ дой нуклеотидной единицы вам известна. Вычислите общую длину молекулы ДНК и сравните с длиной клетки E.coli - 2 мкм.

Ответ: 0,34 нм, 1530 мкм, в 750 раз больше.

6 3 2

7. Будет ли отличаться подвижность гемоглобина S от нор­ мального гемоглобина А при электрофорезе в веронал-мединаловом буфере (рН=8,б)?

Ответ: Скорость движения гемоглобина S уменьшится в связи с тем, что в p-цепях остатки глу в 6-ом положении замещены на вал.

8.При pH 8,0 был проведен электрофорез смеси липидов, со­ держащей а) фосфатидилэтаноламин, б) фосфатидилолин, в) фосфатидилсерин. Укажите, какие из этих соединений должны двигаться к ка­ тоду (К), аноду (А) или оставаться на старте и почему?

Ответ: а) А, б) старт, в) А.

9.Лекарственный препарат аспирин представляет собой слабую кислоту с рК’=3,5. Всасывание его в кровь может происходить через слизистую желудка и тонкого кишечника. Где аспирин легче всасыва­ ется - в желудке или в тонком кишечнике, если величина pH желудоч­ ного сока близка к 1, а pH в тонком кишечнике —к 6.

Ответ: В желудке. Через клеточную мембрану быстро проходят незаряженные гидрофобные молекулы, а ионизированные и полярные

-медленно. Соляная кислота подавляет диссоциацию аспирина, и по­ этому в деионизированном виде он будет всасываться.

10.Гистидин - положительно заряженная аминокислота имеет три ионизированные группы. Напишите, как будет ионизироваться гистидин при pH: 1. 2,3; 2. 6,0; 3. 9,0; 4. 12,0. К какому электроду он будет двигаться в электрическом поле при этих значениях pH?

Ответ:

11. При обработке инсулина надмуравьиной кислотой были раз­ рушены дисульфидные связи и разделены А- и В-цепи. Представлена аминокислотная последовательность В-цепи: Фен-Вал-Асн-Глн-Гис- Лей-Цис-БОзН-Гли-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис- БОзН-Гли-Глу-Арг-Гли-Фен-Фен-Тир-Тре-Про-Лиз-Ала. Укажите, в каких местах произойдет ее расщепление под действием а) трипсина,

633

б) химотрипсина.

Ответ: Фен®Вал-Асн-Глн-Гис-Лей-Цис-вОзН-Гли-Сер-Гис- Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир®Лей-Вал-Цис-803Н-Гли-Глу-Арг(Т)Гли- Фен®Фен®Тир®Тре-Про-Лиз(Т)Ала

12. В лаборатории два студента независимо друг от друга выде­ лили фермент лактатдегидрогеназу (из сердца цыпленка), восстанав­ ливающую пируват в лактат. Фермент был получен в виде концентри­ рованного раствора. Затем оба студента измерили ферментативную активность полученных ими растворов и определена Vmax, Km и удельная активность. При сравнении результатов оказалось, что зна­ чения Km у них совпадали, а удельная активность у одного была равна

100, а у другого —150. Чем отличались выделенные ферменты? Ответ: Степенью очистки. У первого студента фермент был ху­

же очищен от белков, вследствие чего оказалась ниже удельная актив­ ность.

634

ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

1.МЕТОД ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ

ВСЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип! глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, при разрушении которой под влиянием пероксидазы происходит конденса­ ция фенола и р-аминоантипирина в окрашенное соединение. Интенсив­ ность окрашивания при этом пропорциональна концентрации глюкозы.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Рабочий реактив. 2. Стандартный раствор глюкозы.

3.Исследуемая сыворотка.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуе­ мая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл стандартного раствора глюкозы, инкубируют в течение 15 минут при 37 °С и колориметрируют при длине волны 500 нм против холостой пробы. Процедура ручного пипетирования:

Концентрация глюкозы рассчитывается по формуле: Con = (Eon * С„)/ Ест

где Соп - концентрация глюкозы в исследуемой пробе, Еоп - оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация глюкозы в стандарт­ ной пробе, ЕОГ1—оптическая плотность стандартной пробы

Нормальная концентрация глюкозы крови —3,65-6,11 ммоль/л.

Диагностическое значение:

Повышение глюкозы в крови выше 6,11 ммоль/л называется гипер­ гликемией. Различают две основных группы гипергликемий:

1.Инсулярные —связанные с недостаточным содержанием в орга­ низме инсулина или обусловленные неэффективностью его дейст­ вия (сахарном диабете, панкреонекрозе)

2.Экстраинсулярные —не зависящие от влияния инсулина:

-повышенная гормональная функция щитовидной железы (гипертиреоз), надпочечников (феохромоцитома), гипофиза,

-диффузные поражения печени, —механическое и токсическое поражение ЦНС,

635

-травмы и опухоли мозга, -эпилепсия, -сильный эмоциональный стресс,

-отравления окисью углерода, стрихнином и др. веществами. Наиболее существенное значение в формировании экстраинсулярных гипергликемий имеют следующие механизмы:

. -усиленный распад гликогена, -повышенный глюконеогенез, -торможение синтеза гликогена,

-снижение утилизации глюкозы под влиянием гормонов - антаго­ нистов инсулина.

Гипогликемия

Считается, что это состояние имеет место, когда уровень глюкозы в цельной крови менее 2,2 ммоль/л, а при определении ферментативным методом в сыворотке крови —менее 2,5м м о л ь / л .

Симптомы гипогликемии могут быть обусловлены избыточной секрецией адреналина (слабость, потливость, тремор, тахикардия, чув­ ство страха и голода) и дисфункцией ЦНС (головная боль, утрата двига­ тельных функций, спутанность сознания, аномальное поведение, нару­ шение или потеря сознания).

Гипогликемия опасна тем, что глюкоза является жизненно важным энергетическим сырьем для головного мозга.

Причины гипогликемии по механизму р'азвития можно разделить на три группы:

Г.Сниженный выход глюкозы

2.Увеличение утилизации глюкозы

3.Сниженный выход и увеличение утилизации глюкозы На практике гипогликемия чаще всего наблюдается при:

-передозировке инсулина или других сахароснижающих препара­

тов,

-гипотиреозе, надпочечниковой недостаточности, -гиперфункции островков Лангерганса поджелудочной железы

(аденомы, гиперплазии, гипертрофии), -алиментарная гипогликемия (голодание, длительные перерывы

между приемами пищи).

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода: в основе количественного метода лежит биуретовая реакция: в щелочной среде ионы меди образуют с белками ком­ плексные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски рас­

636

твора пропорциональна концентрации белка, которую измеряют фото­ метрически.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Биуретовый реактив (рабочий реактив).

2.Стандартный раствор белка.

3.Сыворотка крови.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуе­ мая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,02 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,02 мл стандартного раствора белка. Через 30 минут колориметрировать при длине волны 546 ±10 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

Концентрация общего белка рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сет)/ Ее,-

где Соп - концентрация общего белка в исследуемой пробе, Еоп —опти­ ческая плотность исследуемой пробы, С„ - концентрация общего белка в стандартной пробе, Еоп - оптическая плотность стандартной пробы

Н орм альная концент рация общ его белка крови у взрослы х —65-85 г/л, у дет ей —56-85 г/л

Диагностическое значение: Плазма крови человека содержит в норме более 100 видов белков. Около 90 % общего белка составляют альбумин, иммуноглобулины, липопротеины, фибриноген, трансферрин. Другие белки присутствуют в плазме в значительно меньших коли­ чествах.

Понижение концентрации общего белка в крови называется гипопро- т еинемией, соответственно повышение —гиперпрот еинемией.

Причинами гипопротеинемии являются:

-алиментарный фактор (т.е. недостаточное поступление белка с пи­ щей): голодание, недоедание, связанные как со всевозможными дие­ тами, так и такими заболеваниями, как стеноз пищевода, стеноз пи­ лорического отдела желудка,

-неусваивание белка вследствие различных заболеваний желудочнокишечного тракта, например: хронические энтериты,

-нарушение биосинтеза белка: гепатиты, циррозы, выраженные ин­ токсикации, врожденные нарушения синтеза отдельных белков — анальбуминемия, болезнь Вильсона-Коновалова,

637

-потеря белка с кровью (острые и хронические кровотечения) и мочой (нефротический синдром),

-перемещение белка в другие ткани —это образование отеков, переход

втак называемое третье пространство (выпоты в серозные полости,

впросвет кишечника,’на ожоговую поверхность),

-повышение распада белка в организме: опухоли, повышенная функ­ ция щитовидной железы, всегда имеет место при кишечной непрохо­ димости,

-физиологическое снижение концентрации белка, например, в по­ следние месяцы беременности и в период лактации.

Относительное снижение концентрации общего белка может на­ блюдаться при увеличении объема циркулирующей жидкости: большое введение жидкостей внутривенно-капельно, прекращении или резком уменьшении диуреза; гиперпродукции антидиуретического гормона ги­ поталамуса, сердечной декомпенсации.

Гиперпротеинемш встречается редко. Абсолютная гиперпротеинемия (т.е. не связанная с нарушением водного баланса) наблюдается при миеломной болезни, хронических полиартритах, длительно протекаю­ щих воспалительных Процессах. Относительная (т.е. вызванная сниже­ нием объема циркулирующей жидкости) - при тяжелых ожогах, пери­ тоните, неукротимой рвоте и поносе, несахарном диабете, непроходи­ мости кишечника, хройической почечной недостаточности, усиленном потоотделении.

Следует помнить, что при некоторых заболеваниях, в частности кишечной непроходимости, разлитом перитоните возникающая относи­ тельная гиперпротеинемия, обнаруживаемая в биохимическом анализе крови, маскирует характерный для этой патологии дефицит белка.

Гипопротеинемия почти всегда связана с гипоальбуминемией, а ги­ перпротеинемия —почти всегда с гиперглобулинемией.

3 . МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬБУМИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С БРОМКРЕЗОЛОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ

Принцип метода состоит в том, что альбумин с бромкрезоловьм зеленым в слабо кислой среде образует окрашенный комплекс синего цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации альбу­ мина.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Раствор бромкрезолового зеленого (рабочий реактив).

2.Стандартный раствор альбумина.

3.Исследуемая сыворотка.

638

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуе­ мая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива (бромкрезолового зелено­ го), затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл стандартного раствора альбумина, инкубируют в течение 10 минут при 37 °С и колориметрируют при 630-690 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

Концентрация альбумина рассчитывается по формуле: Соп = (Eon * Сст)/ Ест

где Соп - концентрация альбумина в исследуемой пробе, Еоп - оптиче­ ская плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация альбумина в стандартной пробе, Еоп - оптическая плотность стандартной пробы

Нормальная концентрация альбумина крови —35-52 г /л.

Определение концентрации альбумина в крови имеет очень важное ди­ агностическое значение. Это обусловлено тем, что:

1. альбумин является показателем, характеризующим тяжесть тех заболеваний, которые сопровождаются гипоальбуминемией;

2.альбумин является основным транспортным белком в организме.

Сальбумином транспортируются: половина всего кальция, свободные жирные кислоты, билирубин, гормоны, лекарственные препараты.

Диагностическое значение: Большее диагностическое значение имеет обнаружение гипоальбхминемии. Клинически проявляется:

—слабостью, -отеками нижних конечностей. При содержании альбумина в сыворот­

ке крови ниже 30 г/л онкотическое давление снижается настолько, что вода из сосудистого русла переходит во внесосудистое —образуются отеки на нижних конечностях, скапливается жидкость в серозных по­ лостях (брюшной - асцит, плевральной - плеврит, перикардиальной — перикардит).

-судорогами, вследствие гипокальциемии. Комплекс альбумин-кальций является транспортной формой кальция. И возникает ситуация, когда при определении в крови нормальной концентрации кальция, на самом деле из-за гипоальбуминемии отмечается скрытый дефицит кальция.

Причины гипоальбуминемии:

1) снижение поступления и синтеза вследствие: недостаточного питания, дефектов пищеварения, нарушения абсорбции, заболеваниях печени. Печень является местом синтеза альбумина, поэтому снижение

639

его концентрации может служить тестом для оценки ее функционально­ го состояния, например: гипоальбуминемия при хроническом гепатите и циррозе имеет неблагоприятное прогностическое значение.

2) увеличение потери альбумина при кровотечениях, анафилакти­ ческом шоке, альбуминурии (т.е. выделении с мочой), при образовании выпотов в серозные полости, при хронических поносах, при хрониче­ ских заболеваниях почек (например, при нефротическом синдроме, ко­ гда концентрация альбумина в крови может достигать 5 г/л при уровне общего белка 25-30 г/л). В хирургической практике это имеет место при так называемых болезнях оперированного желудка (после гастрэктомии или резекции 2/3 желудка), при кишечной непроходимости, остром пан­ креатите, холецистите, острых флегмонах, абсцессах легких. Выражен­ ная гипоальбуминемия или ее усугубление в динамике при тяжело про­ текающих хирургических заболеваниях расценивается как крайне не­ благоприятный прогностический фактор. Это объясняется двумя при­ чинами:

-Уровень альбумина служит показателем эндогенной интоксикации,

ичем выраженнее интоксикация, тем ниже уровень альбумина,

-Гипоальбуминемия приводит к снижению биологической доступ­ ности и длительности нахождения в кровеносном русле используемых фармацевтических препаратов, в частности антибиотиков, гормонов,

сульфаниламидов и некоторых других.

3) усиление катаболизма альбуминов наблюдается у больных гипертиреозом, гиперкортизолемией, длительной лихорадкой, обширны­ ми травмами.

Чаще всего изменения содержания альбумина в плазме бывают вторичными, т.е. причиной являются какие-либо заболевания. Первич­ ные нарушения очень редки и представляют собой наследственные за­ болевания. К ним относится анальбуминемия (т.е. отсутствие альбуми­ на) и двойная альбуминемия (бисальбуминемия) —.протекает бессим­ птомно, при электрофорезе белков сыворотки крови выявляют две фракции альбуминов.

Гипералъбуминемия. Абсолютная гиперальбуминемия практически не встречается. Относительная связана с гипоили дегидратацией, т.е. со снижением объема циркулирующей жидкости.

4. МЕТОД ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода состоит в том, что холестерин окисляется холестеролоксидазой с высвобождением перекиси водорода, которая в при­ сутствии пероксидазы превращает р-аминоантипирин в окрашенное со-

640