Аденоассоциированные вирусы
Аденоассоциированные вирусы (греч. aden – железа и лат. associare – соединять) – мелкие ДНК-содержащие вирусы, размножающиеся только в присутствии аденовирусов; входят в состав группы парвовирусов.
Аденоассоциированный вирус (AAV) – малый вирус, инфицирующий клетки человека и некоторых других приматов. Аденоассоциированный вирус, по-видимому, не вызывает заболевания у человека и, соответственно, вызывает слабый иммунный ответ, присутствующий в организмах 90% людей.
Аденоассоциированный вирус может инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки и может встраивать свой геном в геном хозяина. Эти особенности делают AAV особенно привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии.
Аденоассоциированные вирусы описаны итальянскими вирусологами Аркетти и Боччарелли (I. Archetti, D. S. Bocciarelli,) в 1964 году. Они обнаруживаются в культурах аденовирусов, изолированных от людей и животных.
Размер частиц AAV 22–24 нм, они обладают кубической симметрией икосаэдрального типа. Их вес 7,5× 106 дальтон. Предполагают, что капсид аденоассоциированных вирусов состоит из 12 капсомеров. В состав вириона входят три структурных белка с молекулярным весом около 66 тыс., 80 тыс. и 92 тыс. дальтон. Содержат однонитчатую ДНК с мол. весом 1,5–1,7×106 дальтон. На нее приходится от 18,9 (тип 1) до 26,5% (тип 4) веса вириона, причем гуанин-цитозин составляет от 53% (тип 2) до 58–62% (тип 4) веса ДНК.
Аденоассоциированные вирусы весьма устойчивы к нагреванию: при температуре 800С они инактивируются за 30 мин., а при 600 С – лишь через 4 часа. Они не изменяются в течение 30 дней при температуре 250С и 6 месяцев – при температуре 2 – 40С. Устойчивы к действию эфира. Инактивируются ультрафиолетовыми лучами.
Известно несколько серологических типов аденоассоциированных вирусов. У приматов встречаются четыре типа, у людей типы 1, 2, 3, у обезьян – типы 1, 2, 3, 4. У типов 2 и 3 имеется некоторая антигенная общность. Обнаружены аденоассоциированные вирусы также у крупного рогатого скота (вирус Х7), свиней, собак и кур. Клинически выраженных заболеваний они, по-видимому, не вызывают. Они нередко выделяются вместе с аденовирусами из глоточных и ректальных смывов у людей при аденовирусных болезнях. Антитела к аденоассоциированным вирусам типов 1 – 3 обнаруживаются в сыворотках 20 – 50% людей, инфицирование происходит обычно в раннем детстве. Еще шире данные вирусы распространены среди обезьян (макаки – резусы и зеленые африканские мартышки). Вирус Х7, помимо крупного рогатого скота, может, очевидно, инфицировать людей, поскольку у них найдены соответствующие антитела.[6]
Относительно недавно используемый для генотерапии адено-ассоциированный вирус (AAV) является простым непатогенным одноцепочечным ДНК-вирусом. Два его гена (cap и rep) расположены между двумя терминальными инвертированными повторами, определяющими начало и конец вируса, и содержат пакующую последовательность. Ген cap кодирует оболочечные белки вирусного капсида, а продукт гена rep обеспечивает репликацию вируса и его последующую интеграцию с геномом клетки-реципиента. AAV нуждается в дополнительных генах для своей репликации в пакующих клетках. Они обеспечиваются хэлперными вирусами (обычно это аденовирусы или вирус простого герпеса) [7] (рис. 1).
Рис.1. Жизненный цикл AAV. AAV размножается в клетках, коинфицированных аденовирусом. В отсутствие аденовируса AAV поддерживается в латентном состоянии, интегрировавшись с хромосомой-19 (AAVS1). Латентный AAV может стать репликационно-активным при условии суперинфицирования клетки аденовирусом. [8].
Трансдукция вектора в клетку-мишень происходит различными путями, включающего интеграцию с геномом хозяина, экспрессию трансдуцированных генов с линейных и кольцевых форм вируса [9], гомологичную [10] и негомологичную рекомбинацию ДНК-вектора с хромосомной ДНК [11]. Для изменения тропизма AAV используют те же приемы, что и для изменения тропизма аденовирусных векторов [8]. Исследования «предпочитаемых» сайтов интеграции AAV с геномом человека показали, что в основном они располагаются в пределах CpG- островков и в начале генов, а его рекомбинация с хромосомной ДНК человека в основном носит негомологичный характер. В отличие от ретровирусного вектора, вектор на основе AAV не содержит интегразу, и он может интегрироваться с хромосомой только при наличии в ее участках одно- и двунитевых разрывов. CpG-островки проявляют себя измененной структурой хроматина и имеют повышенную чувствительность к нуклеазам. В репликации ДНК они участвуют в качестве участков начала репликации с высокой вероятность появления разрывов в цепи ДНК. Этот феномен объясняет интеграционное предпочтение AAV к CpG-островкам [11].
AAV может инфицировать различные типы клеток. В присутствии продукта гена rep вирусная ДНК способна интегрироваться преимущественно с хромосомой-19 человека. В векторах, создаваемых на основе AAV, rep и cap гены замещаются на трансгены. Выход вирусных частиц составляет (1011-1012) см3. Емкость AAV-векторов не превышает 3,5-4,0 т.п.о. чужеродной ДНК, что исключает их использование для клонирования крупных генов. AAV-вектор, содержащий ДНК человеческого фактора IX, был использован исследователями для трансфецирования печени и мышц иммунокомпетентных мышей. Трансфецированные клетки продуцировали в кровь мышей терапевтические количества белка фактора IX более 6 мес. [7].
Аденоассоциированные вирусы могут размножаться только в присутствии «помощников» – аденовирусов. Они не обладают специфичностью в отношении своих «помощников», которыми могут быть любые аденовирусы человека, обезьян и др.
В некоторой степени функцию «помощников» размножения аденоассоциированных вирусов могут выполнять герпетические вирусы человека и животных (возбудители простого герпеса, ветрянки, цитомегалии человека, вирус Эпстайна–Барра и возбудитель инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота). В этом случае синтезируется только инфекционная ДНК аденоассоциированного вируса и его белковая оболочка (капсид), но соединение этих компонентов с формированием вирусных частиц, способных к репродукции, не происходит. [6]
Аденоассоциированный вирус дикого типа имеет некоторые преимущества для генной терапии. Одним из основных преимуществ является то, что этот вирус не является патогенным. Аденоассоциированный вирус может инфицировать неделящиеся клетки и может встраиваться в геном хозяина по специфическим участкам (AAVS1) девятнадцатой хромосомы.
В последнее время он рассматривается как потенциальный вектор – переносчик генов – для осуществления генной терапии. Однако проблема заключается в том, что в организме подавляющего большинства людей содержаться антитела к AAV, отслеживающие и нейтрализующие частицы вируса сразу же после их попадания в организм, что лишает смысла всякие попытки проведения генной терапии с его помощью.
Исследователи Калифорнийского университета (г. Беркли) под руководством Дэвида Шафера (David Schaffer) решили попытаться ускорить эволюцию AAV и направить этот процесс таким образом, который позволил бы вирусу получить способность проскальзывать мимо иммунной системы человека и, таким образом, повысил бы его ценность в качестве генного вектора.
До сих пор направленная эволюция использовалась в основном для изменения активности ферментов (повышения их эффективности в отношении нового субстрата или усиления каталитической активности) и для улучшения способности антител связываться со специфическими мишенями. В отношении вирусов подобные подходы никогда ранее не использовались.
Рис.2 Общий вид аденоассоциированного вируса
Частица AAV состоит всего из двух генов, покрытых белковой оболочкой – капсидом (рис.2). Белки капсида распознаются антителами, именно поэтому они были выбраны в качестве мишени для направленной эволюции (участки молекулы белка, распознаваемые иммунной системой, на картинке аденоассоциированного вируса обозначены желтым). Для обеспечения первичного материала эволюции – генетических вариаций, из которых природа выбирает наиболее жизнеспособные, – исследователи создали мутантные вирусы путем индукции небольших изменений в их генах с помощью подверженной ошибкам ПЦР в комбинации с методом искусственной рекомбинации. После этого мутантные вирусные частицы помещались в сыворотку крови кроликов, иммунизированных против AAV, содержащую большое количество специфических к нему антител. В результате выживали только вирусы, несущие мутации, позволяющие им избегать взаимодействия с антителами.
После трехкратного пропускания вирусных частиц через сыворотку, концентрация антител в которой повышалась с каждым раундом, выжившие вирусные частицы были выделены и снова подвергнуты ПЦР, что привело к появлению новых мутаций. Второе поколение вирусов-мутантов также прошло через три этапа взаимодействия с иммунными сыворотками. Полученные в результате этого «искусственного-естественного» отбора частицы аденоассоциированного вируса обладали гораздо более выраженной способностью избегать встречи со специфическими антителами, чем частицы природного штамма. Один из полученных штаммов выживал почти в 2 раза лучше, чем его предок, а еще два выжили в организмах мышей, в сыворотке крови которых концентрация антител к природному штамму была почти в 1000 раз выше, чем необходимо для уничтожения вируса.
С помощью секвенирования генома наиболее устойчивых вариантов вируса ученые установили, что белки капсида новых штаммов отличались от первоначальных белков, состоящих примерно из 1500 аминокислот, только семью аминокислотами, две из которых ответственны за нарушение процесса взаимодействия с антителами.
Работа над одним вирусным поколением занимает около месяца, поэтому авторы надеются в течение ближайшего года создать большое количество новых усовершенствованных штаммов. Кроме того, они планируют начать эксперименты с использованием человеческой сыворотки.
Использование этой методики может быть также успешно использовано для улучшения других характеристик аденоассоциированного вируса, необходимых для его успешного использования в качестве генного вектора.
Конечно, существует еще целый ряд проблем, которые должны быть решены, например, как научить вирус проникать в те клетки, которые он обычно не проникает, или как ускорить процесс его продвижения в организме. Кроме всего прочего, авторы работы осознают, что новая методика может быть использована для искусственного повышения патогенности опасных для человека вирусов, однако, по словам Дэвида Шафера, в мире уже существуют другие, более легкие методики, которые могут быть использованы в этих целях.[12]
В настоящий момент препараты на основе аденоассоциированного вируса для лечения муковисцидоза и гемофилии проходят первый этап клинических испытаний. Многообещающие результаты были получены после первой фазы клинических испытаний препаратов против болезни Паркинсона. По результатам других клинических испытаний показана безопасность векторов на основе аденоассоциированного вируса при болезни Канавана, мышечной дистрофии и при синдроме Бильшовского-Янского.
Пока более вероятным направлением развития допинга представляется не внедрение в организм спортсмена чужеродных генов, а модификация его собственных.