1. Сывороточный

Mr=170 тыс. S=7.

Концентрация в сыворотке – 15-25 % от общего количества Ig.

Не может прецип-ть растворимые АГ, не связывает комплемент.

Принимает участие в нейтрализации токсинов, является термоустойчивым.

Синтезируется в селезенке, лимфоузлах, в слизистых облочках.

Активно поступает в слюну, бронхиальный секрет, молозиво.

2. Секреторный

Отличается наличием добавочного структурного компонента.

Mr=380 тыс. S=11.

Синтезируется в слизистых оболочках.

Функция – местная защита слизистой оболочки. Способны подавлять бактериальную адгезию, способны нейтрализовать вирусы.

4) Ig D

Mr=160 тыс. S=7.

В крови не более 1 %.

Предполагают, что он является одним из Ig, входящих в состав рецепторов В-лимфоцитов.

Способен активизировать комплемент по альтернативному пути, термостабилен. Обладает антивирусной активностью.

5) Ig E

В1ые был обнаружен в 60х гг 20 века. Относили к АТ группы реагины.

Mr=190 тыс. S=8,5.

Концентрация – 0,25 мг на 1л

Является термостабильным АТ. Инактивируется при t-ре более 65С. Не способен быстро и прочно связываться с комплементом, но может связываться с тканевыми базофилами. Принимает участие в реакции гиперчувствительности немедленного типа. Обуславливает у человека болезни– сенная лихорадка, крапивница, бронхиальная астма.

При аллергических заболеваниях концентрация Ig E значительно увеличивается и может быть = 1,6 мг на 1л

Играет защитную роль при гельминтозных заболеваниях. Способствует усилению фагоцитарной активности макрофагов.

3. ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ

1. Приготовление фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколла-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.

2. Приготовление раствора рентгеноконтрастного вещества (например, уротраста): 10.14 (20.28) мл 75% раствора уротраста доводят дистиллированной во дой до 21 (42) мл.

3. Приготовление градиента плотности: растворы фиколла и уротраста сме шивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, которая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то добавляют раствор фиколла, если ниже - раствор уротраста. Градиент плотности можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4 в склянке из оранжевого стекла. При отсутствии фиколла градиент плотности можно приготовить только из одного рентгеноконтрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раство ра уротраста смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл 0.1% раствора хлористого натрия. Полученный при этом 14.3% раствор уротраста имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве гра диента плотности.

4. Выделение лимфоцитов: периферическую кровь из локтевой вены в объеме 10 мл берут в пробирку, содержащую гепарин, в конечной концентрации 25 ед в 1 мл крови. Кровь должна отстояться в течение 40-60 мин при комнатной температуре до четкого разделения эритроцитов и плазмы.

4а. В центрифужную пробирку наливают 2-3 мл градиента плотности, на не¬го наслаивают 4-6 мл отстоявшейся плазмы и верхний слой эритроцитов. Соот¬ношение объемов градиент: плазму выдерживают в пределах 1:2-1:4.

46. Пробирки центрифугируют в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорени¬ем 200 g (1500-1800 об/мин) при температуре 20°С. В процессе центрифугиро¬вания эритроциты и гранулоциты "проваливаются" в градиент и оседают на дно пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее в основном из лимфоцитов с приме¬сью моноцитов. Над слоем лимфоцитов находится плазма. Плазму собирают в отдельную пробирку для последующего анализа на иммуноглобулины; лимфо¬циты отсасывают в сухую коническую центрифужную пробирку.

4в. К суспензии лимфоцитов добавляют 3-4 мл среды 199 и содержимое про¬бирки тщательно перемешивают. После этого пробирки центрифугируют с ус¬корением 200-300 g при температуре 20°С, затем надосадочную жидкость удаляют, а процедуру отмывки повторяют еще один раз.

4г. После отмывания готовят рабочую концентрацию лимфоцитов, содер¬жащую 2x10 клеток в 1 мл. Перед приготовлением рабочей концентрации сосчитывают исходное количество лимфоцитов:

- к 0,1 мл осадка отмытых клеток добавляют 0,9 мл среды 199, суспензию тщательно перемешивают;

- в чистую пробирку вносят 0,38 мл 3% раствора уксусной кислоты и 0,02 мл взвеси лимфоцитов;

- в камере Горяева подсчитывают лимфоциты в 100 больших квадратах и по лученное число умножают на 50000. Результат соответствует количеству лим фоцитов в 1 мл суспензии. Для приготовления рабочей концентрации лимфоци тов полученное число делят на 2^10, из результата вычитают 1, остаток пред ставляет собой количество питательной среды 199 в мл, которое необходимо добавить в пробирку с лимфоцитами.

Приготовленную по данной методике суспензию лимфоцитов можно хра¬нить при температуре + 4°С в течение 2 часов.

ОПР-Е ДИФФЕР АГ ЛИМФОЦИТОВ

Описание метода

1. Приготовление забуференного изотонического раствора хлорида натрия (ЗФР): 15,6 г NaH2PO растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1 литра (раствор № 1); 35,8 г Na2HPO растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1 литра (раствор № 2). Смешать 13 частей раствора № 1 и 37 частей раствора № 2, в полученной смеси растворить 8,5 г NaCl; pH раствора должен составить 7,2-7, 4.

2. Проведение реакции. Выделенные на градиенте плотности лимфоциты дважды отмывают охлажденным до 4°С ЗФР в течение 10 мин при 1000-1500 об/мин; суспензию лимфоцитов разводят ЗФР до концентрации 2x10 клеток в 1 мл.

Тщательно отмытые и обезжиренные предметные стекла покрывают 0.01% раствором поли-Ь-лизина в ЗФР путем нанесения его на стекло с последующей инкубацией в течение 1 часа при 37°С (при отсутствии поли-Ь-лизина можно воспользоваться также 0,4% раствором формвара в дихлорэтане, при этом стекло однократно опускают в раствор на 5-10 с; следует помнить, что раствор токсичен и работа с ним требует определенных мер предосторожности - все манипуляции необходимо проводить в вытяжном шкафу). На стекло, покрытое слоем поли-Ь-лизина или формвара, наносят 0,05 мл суспензии лимфоцитов (для определения Т-лимфоцитов и их субпопуляций делают три мазка для подсчета Т-лимфоцитов (CD3*), Т-хелперов (CD4+) и Т-супрессоров (CD8+), мазки можно сделать на трех стеклах или на участках одного стекла, в последнем случае мазки следует пометить с помощью воскового карандаша на обратной стороне стекла. Клетки осаждают на стекле во влажной камере при температуре 37°С (в качестве влажной камеры используют чашку Петри с вложенной в нее влажной фильтровальной бумагой). После осаждения клеток препарат осторожно промывают круговыми движениями последовательно в трех сосудах с охлажденным ЗФР. Мазок подсушивают фильтровальной бумагой (не касаясь монослоя кле¬ток). На мазок лимфоцитов наносят один из растворов моноклональных антител, содержащий 3 мкг/мл ОКТЗ, ОКТ4 или ОКТ8 в ЗФР и инкубируют во влажной камере в течение 40 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации препарат осторожно промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. На мазок наносят 10-15 мкл кроличьего антимышиного иммуноглобулина, меченного ФИТЦ, разведенного 1:50 в ЗФР, и инкубируют во влажной камере в течение 30 мин при комнатной температуре. Препарат промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. На мазок наносят 10-15 мкл 0,0004% (1 мг в 250 мл дистиллированной воды) этидиума бромида; стекло слегка подогревают, проводя несколько раз над пламенем горелки. Препарат промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. Удаляют фильтровальной бумагой избыток жидкости и на мазок наносят 50% раствор глицерина в ЗФР; препарат накрывают покровным стеклом и с помощью фильтровальной бумаги удаляют избыток глицерина.С целью сохранения препарата от высыхания края покровного стекла окантовывают расплавленным парафином.

Учет результатов

Препарат анализируют с помощью люминесцентного микроскопа (последовательность фильтров, начиная от ртутной лампы: ЗСС, ЗСС 24, ФС-1, БС-8). В поле зрения микроскопа видны лимфоциты, ядро которых светится кирпично-красным цветом, а антительный комплекс, связавшийся с поверхностными рецепторами клеток, имеет точечное свечение изумрудно-зеленого цвета. Клетки, имеющие диффузное изумрудно-зеленое или чисто зеленое свечение, являются мертвыми и при анализе не учитываются. В нескольких полях зрения сосчитывают общее число лимфоцитов и среди них количество клеток, имеющих точечное изумрудно-зеленое свечение. Процент лимфоцитов, имеющих на своей поверхности дифференцировочные антигены CD3+, CD4+,CD 8+ определяют после подсчета 200 клеток. По результатам подсчета количества CD4+ и CD 8+ лимфоцитов, т. е. Т-хелперов и Т-супрессоров, рассчитывают индекс дифференцировки лимфоцитов (ИД): CD4+/CD8+.

Билет №15.

1.Иммунитет. Оп-ие понятия. Виды им-та и их хар-ка.

2.Реакции ГЗТ. Типы аллергических р-ий ЗТ. Мех-м развития р-ии и их биолог.смысл

3.Реакция Кумбуса.

1.Иммунитет. Оп-ие понятия. Виды им-та и их хар-ка.

Им-т – с лат. Imirtunitas – освобождение или избавление от чего-либо.

Им-т – это состояние невосприимчивости организма к воздействию болезнетворных микробов, продуктов их жизнедеятельности (токсинов), а также других чужеродных веществ биологической природы.

По происхождению Приобретенный:1естественный – активный (постинфекционный) и пассивный (транспланцентарный) передается от матери плоду.2Приобрет иск-ныйактивный и пассивный.

Врожденный им-т – невосприимчивость к инфекционным агентам, которая детерминирована геномом.Свойственен живым организмам определенного вида к определенному возбудителю инфекции.Передается из поколения в поколение.человек не может заболеть чумой собак- лежит отсутствие в клетках организма рецепторов, субстратов наличие веществ, блокирующих размножение микробов.прочный, но не абсолютный.

Пастер куры не болеют сибирской язвой.

Приобретенный им-т –специфичность.Активный им-т образуется после естественного перенесения болезни человеком или животнымМожет происходить скрытая иммунизация.Пассивный им-т – характерен для новорожденных.Приобретается или за сет трансплантации или поступления АТ от матери.

Естественный приобретенный активный им-т может сохраняться 1-2 года. Иногда может быть и пожизненно.Естественный приобретенный пассивный им-т обеспечивает состояние невосприимчивости от нескольких недель до нескольких месяцев.Искусственный приобретенный активный им-т возникает в рез-те иммунизации организма вакцинами через 7-14 дней после вакцинации и сохраняется до нескольких месяцев или лет.Искусственный приобретенный пассивный им-т создается при введении им-кой сыворотки в организм, содержащие антитела.Пассивный им-т как правило не стоек, не более 15 дней.

Им-т делят на:- антибактериальный - противовирусный- антиотоксический

В зависимости от механизмов защиты- гуморальныйклеточный