16. Адсорбционная хроматография. Тонкослойная хроматография (тсх).
Сущность метода ТСХ. Коэффициент подвижности, относительный коэффициент подвижности, степень (критерий) разделения, коэффициент
разделения. Материалы и растворители, применяемые в методе ТСХ.
АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворителем, так и с адсорбентом.
В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования π-комплексов или комплексов с переносом заряда. Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление хемосорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появлению продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.
Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик вещества симметричен и время удерживания не зависит от размера пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую форму, что приводит к некоторой асимметрии пика с образованием хвоста.
Тонкослойная хроматография (ТСХ).
Тонкослойная хроматография (ТСХ) - вариант хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов смеси в плоском тонком слое (толщина 0,1-0,5 мм) сорбента при их движении в потоке подвижной фазы (элюента). Последняя представляет собой, как правило, жидкость, однако осуществлен и газовый вариант тонкослойной хроматографии. В качестве сорбентов используют мелкозернистые силикагель, Аl2О3, целлюлозу, крахмал, полиамид, иониты и др. Суспензиями этих сорбентов покрывают пластинки из стекла, фольги или пластика; для закрепления слоя применяют крахмал, гипс или др. связующие. Выпускаются готовые пластинки с уже закрепленным слоем сорбента. Элюентами служат обычно смеси органических растворителей, водных растворов кислот, солей, комплексообразующих и др. веществ.
В зависимости от положения пластинки и направления потока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную тонкослойную хроматографию. По технике работы выделяют фронтальный анализ (когда подвижной фазой служит анализируемая смесь) и обычно используемый элюционный вариант.
Тонкослойная хроматография применяется для разделения и анализа как органических и неорганических веществ: практически всех неорганических катионов и мн. анионов, в т.ч. близких по свойствам ионов благородных металлов, РЗЭ, а также полимеров, лекарственных средств, пестицидов, аминокислот, липидов, алкалоидов и т. д. С помощью метода тонкослойной хроматографии удобно анализировать микрообъекты (малые количества в-в), оценивать чистоту препаратов, контролировать технологические процессы и состав сточных вод, изучать поведение различных ионных форм элементов, предварительно подбирать условия для колоночной хроматографии. Метод тонкослойной хроматографии предложен Н.А. Измайловым и М.С. Шрайбер в 1938
Суть метода тонкослойной хроматографии заключается в движении растворителя вещества в слое сорбента и пространственном распределении разных компонентов в зависимости от их индивидуальных характеристик и свойств. Дело в том, что молекулы разного состава и строения сорбируются (осаждаются) на твердой поверхности хроматографической пластины по-разному. Поэтому сложные многокомпонентные системы постепенно разделяются на отдельные составные части. Двигаясь с различной скоростью вдоль слоя сорбента, отдельные, уже разделенные, компоненты образовывают хроматограмму. Каждое цветовое пятно соответствует определенному химическому веществу. Бесцветные вещества при этом освещают ультрафиолетом, под воздействием которого множество соединений начинают флюоресцировать, или подвергают обработке специальным окрашивающим реактивом
Коэффициент подвижности
Для количественной оценки подвижности вещества в хроматографической
системе используют коэффициент подвижности Rf, равный отношению
расстояния l, пройденного веществом (мм), к расстоянию, пройденному
растворителем L(мм):
Коэффициент подвижности Rf можно определить экспериментально: на хроматограмме измеряют расстояние l от линии старта вещества до центра пятна и расстояние от линии старта до линии финиша растворителя –L.
Величина Rf характеризует положение зоны вещества на хроматограмме.
Обычно коэффициент подвижности лежит в пределах
Rf = 0-1. Оптимальное значение составляет 0,3 –0,7. Условия хроматографирования подбираются так, чтобы величина Rf отличалась от нуля и
единицы.
Для воспроизводимости и строго постоянных условий хроматографирования
Rf = const. Разделение веществ практически возможно, еслиRf (I)–Rf (II)≥ 0,1.
Степень разделения
Способом оценки степени разделения двух веществ, регистрируемых на хроматограмме в виде соседних пиков, является вычисление величины отношения удвоенного расстояния “а” между максимумами пиков к сумме ширины пиков у основания 11 и 12 (рис. 16).
Это отношение служит мерой разделения двух компонентов, называется степенью разделения Rs и позволяет непосредственно из хроматограммы оценить степень эффективности разделения.
рис
1
Если расстояние между вершинами пиков “а” заменить разностью времен удерживания (t2 – t1), ширину пиков у основания выразить через размывание (а), использовать выражения для относительного удерживания (а) и числа теоретических тарелок (n) соотношение (38) преобразуется в уравнение:
рис
2
Которое позволяет установить влияние числа теоретических тарелок (n) и коэффициента емкости колонки для второго компонента (Jc2) на величину степени разделения двух соединений.
С помощью этого уравнения можно рассчитать, какой эффективностью должна характеризоваться хроматографическая колонка для получения заданного значения степени разделения Rs при заданном значении емкости колонки по отношению ко второму компоненту k2 и заданном значении относительного удерживания разделяемых компонентов а.
Если в соотношении (39) число теоретических тарелок выразить через отношение длины колонки к высоте, эквивалентной теоретической тарелки
N = L, то поскольку в зафиксированных условиях процесса разделения большая h
рис
3
Часть параметров этого уравнения остается постоянными, величина степени разделения оказывается пропорциональной корню квадратному из длины
Это соотношение показывает, что в первом приближении повысить эффективность процесса разделения можно простым увеличением длины колонки, при сохранении остальных параметров процесса разделения постоянными.
Коэффициент разделения.
Сорбенты
Наиболее распространенным сорбентом является силикагель. Силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служит группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи. Окись алюминия. Окись алюминия является слабо основным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100-150 0С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя. Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем. Кремнекислый магний менее полярный чем силикагель и обычно используется в случаях, когда более полярные адсорбенты не дали эффективного разделения. Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Но как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно. В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента используют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или активные сульфогруппы, участвующие в ионном обмене. Тонкослойная хроматография с такого типа пластинками, проводится с подвижными фазами содержащими сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений. Вышеперечисленные сорбенты являются наиболее распространенными, но помимо этих существуют множество веществ, используемых как сорбенты. Это тальк, сульфат кальция, крахмал и т.д В то же время даже уже указанные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств (пропитка сорбентов реактивами, например AgNO3, создание пластин с обращенной фазой). Именно такое разнообразие возможных фаз при минимальных затратах позволяют использовать ТСХ для хроматографирования огромного числа веществ.
Растворители
В тонкослойной хроматографии, в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо смеси веществ (системы) в определенном соотношении. Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам : Выбирают такую систему, в которой разделяемые компоненты имеют небольшую растворимость (если растворимость вещества высокая, то вещества будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте). При распределительной хроматографии или при использовании обращенных фаз, растворимость веществ должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной.
· Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.
· Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.
· Система должна полностью разделять вещества близкого строения, причем различия в Rf должно быть не менее 0,05.
· Система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов.
· В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения Rf и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения Rf лежало в пределах 0,05-0,85.
· При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ. Так, при хроматографировании веществ, имеющих основные свойства система не должна обладать кислотными свойствами и наоборот.
Эти рекомендации дают предварительную оценку выбранной системы. Последнее слово все равно остается за экспериментом.