V. Зміст теми

У імунології застосовується цілий ряд експериментальних методів з інших областей біології. Так, виділення антигенів і антитіл проводять за допомогою біохімічних методів фракціонування білків, гени імунологічно важливих молекул секвеніруют звичайними молекулярно-генетичними методами. Разом з тим в імунології розроблені і свої спеціальні методи дослідження, засновані на взаємодії антиген-антитіло. Ці імунологічні методи в свою чергу знайшли застосування в різних галузях біології. Зокрема, будь-які молекули, що володіють антигенними властивостями, можна виявляти в тканинах імуногістохімічними методами. Для кількісного визначення таких молекул, присутніх в надзвичайно низьких концентраціях, застосовують радіоіммуноаналіз і ферментний іммуносорбентний аналіз. В даний час існують сотні різноманітних імунологічних методів: найбільш широко вживані з них описані в цій роботі.

Взаємодія антиген-антитіло

Реакція преципітації. Одним з перших описаних проявів взаємодії антиген-антитіло було утворення преципітату при змішуванні обох реагентів в еквівалентних або близьких до еквівалентних кількостях. Воно спостерігається при постановці класичної реакції преципітації з розчинними антигенами і антитілами. Якщо проводити цю реакцію в агаровому гелі, можна диференціювати окремі реакції антиген-антитіло, зумовлені різними популяціями антитіл, присутніми в сироватці. Такий метод, названий методом подвійного иммунодиффузии, застосовується також для перевірки подібності між різними антигенами.

Однак деякі суміші антигенів занадто складні для поділу просто шляхом дифузії і преципітації, і для аналізу таких сумішей був розроблений метод імуноелектрофорез - перш ніж виявляти антигени візуально в реакції преципітації, їх поділяють по заряду за допомогою цього методу.

Методи, засновані на дифузії в гелі, дозволяють визначати антигени і антитіла лише якісно, ​​кількісну ж оцінку реагуючих компонентів проводять розробленим пізніше методом простої радіальної иммунодиффузии.

Иммунодиффузии в електричному полі можна виробляти з одночасним зустрічним рухом антигенів і антитіл; цей спосіб названий зустрічним електрофорезом. Аналогічна модифікація простий радіальної иммунодиффузии отримала назву ракетний електрофорез.

Описані методи використовуються для визначення антигенів і антитіл у концентрації від 20 м кг / мл до 2 мг / мл.

Реакції гемаглютинації та зв'язування комплементу

Якщо антитіла присутні в таких низьких концентраціях, що їх не вдається виявити і кількісно визначити за допомогою зустрічного і ракетного електрофорезу, застосовують реакцію гемаглютинації. Вона заснована на здатності антитіл перехресно зв'язуватися з еритроцитами, взаємодіючи з їх поверхневими антигенами.

Реакція антиген-антитіло веде до утворення імунних комплексів, які пов'язують комплемент при його активації класичним шляхом, і на цьому заснований один з кількісних методів визначення антигенів і антитіл. За допомогою реакцій гемаглютинації та зв'язування комплементу вдається виявляти антитіла, присутні в концентрації <1 мкг / мл.

Пряма і непряма імунофлуоресценція

Імунофлуоресцентний методи широко використовуються для виявлення аутоантитіл і антитіл до тканинних і клітинних антигенів. Хоча ці методи технічно більш складні, ніж описані вище, вони мають явну перевагу в тих випадках, коли потрібно визначити число видів антитіл. Використовуючи зрізи тканин, на одному предметному склі можна виявити антитіла до кількох різних антигенів, встановивши при цьому їх внутрітканинне або внутрішньоклітинний розподіл.

Крім того, за допомогою імунофлуоресцентний тестів можна ідентифікувати окремі клітини в клітинній суспензії, тобто виявляти антигени на поверхні живих клітин. Для цієї мети суспензію живих клітин, флуоресцентно забарвлених специфічними реагентами, пропускають через проточний флуоресцентний клітинний сортер - прилад, що вимірює інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектру і потім розділяє клітини за параметрами світіння. Даний метод дозволяє виділяти різні клітинні популяції, тобто розділяти клітини, які несуть специфічні поверхневі антигени і відповідно до цього забарвлені різними флуоресцентно міченими антитілами.

Імунологічний аналіз антигенів і антитіл за допомогою мічених реагентів

Методи цієї категорії відрізняються дуже високою чутливістю і економічністю у витрачанні реагентів. Найбільш поширений з усіх імунологічних методів - це, ймовірно, іммуносорбентний аналіз антитіл із застосуванням лігандів, мічених радіоізотопами чи ферментами; він дозволяє досліджувати велику кількість зразків у відносно короткий час. Кількість антигену можна вимірювати за допомогою методу «подвійний антигенної пастки» або конкурентного іммуноаналі через із застосуванням будь-якого маркера для визначення.

Імуноблотинг і іммунопреціпітація

Описані вище методи зазвичай застосовують для визначення рівня конкретних відомих антигенів і антитіл, однак часто необхідно ідентифікувати та охарактеризувати не відомі заздалегідь антигени, що містяться в багатокомпонентної суміші. Для цієї мети особливо підходить імуноблотинг.

При проведенні иммуноблоттинга складну суміш антигенів спочатку піддають гель-електрофорез, а потім фракціоновані пептиди переносять на лист нітроцелюлози для ідентифікації індивідуальних антигенів за допомогою специфічних антисироваток. Виробляючи попереднє розділення в гелі з додецилсульфату натрію або в гелі для ізо-електричного фокусування можна отримати дані про розміри і ізоелектричної точці досліджуваних антигенів, а також про подібність між ними.

У деяких випадках в результаті електрофорезу в гелі та процедури блотів антиген денатурує так, що деякі з його епітопів руйнуються і втрачають здатність зв'язуватися зі специфічними антитілами. У такій ситуації замість блотів слід використовувати іммунопреціпітація, щоб встановити, який антиген пов'язують антитіла. Даний метод може бути застосований для визначення як розчинних, так і мембранних антигенів.

Отримання чистих антитіл

У імунологічних дослідженнях часто виникає необхідність в отриманні очищених препаратів антитіл, тобто Антигенспецифічність або неспецифічних імуноглобулінів. Виділення неспецифічних імуноглобулінів із сироватки зазвичай проводять шляхом послідовного фракціонування білків, яке включає наступні етапи.

• Осадження гамма-глобулінів в 30-50% розчині сульфату амонію.

• Гель-фільтрація для отримання молекул відповідних розмірів.

• Іонообмінна хроматографія з метою виділення молекул, що несуть сумарний позитивний заряд при нейтральному рН.

• Афінна хроматографія з використанням природних лігандів імуноглобулінів, наприклад стафілококового білка А.

Виділення антигенспецифічність імуноглобулінів здійснюють методом афінної хроматографії. Антиген «пришивають» до частинок сефарози і пов'язані з ним «чисті» антитіла елюіруют з імуносорбент хаотропні агентами або буферним розчином. Метод афінної хроматографії застосовують і для отримання очищених препаратів антигенів.

Отримання моноклональних антитіл

Іншим способом отримання індивідуальних антитіл певної специфічності служить гібридомної технологія - створення Іммортал-зовано лінії клітин, що продукують антитіла тільки однієї специфічності, тобто моноклональні. У такій культурі можна підтримувати антитілоутворення невизначено довгий час. Моноклональні антитіла незрівнянно краще відповідають цілям імуноаналізу, ніж гетерогенні сироватки, одержувані від імунних тварин, і тому знайшли широке застосування в різних галузях біології в якості високоспецифічних зондів.

Ефективно продукувати моноклональні антитіла можуть будь-які В-клітини, необхідно лише зробити їх для цього безсмертними і проліферуючими. Найчастіше для цієї мети отримують гібридні клітини - шляхом злиття мишачих спленоцітов з мієломною В-клітинами від мишей тієї ж лінії, не секретуючими власних антитіл. Можливо також отримати міжлінійні або міжвидові гібриди, проте вони часто нестабільні. Інший метод імморталізаціі - це трансформація клітин, наприклад у випадку В-клітин людини шляхом інфікування вірусом Епштейна-Барр.

Розроблено також новий метод отримання антитіл, заснований на використанні бактеріофагів. За допомогою цього цікавого методу вдається отримати експресію на поверхні ниткоподібного бактеріофага М13 варіабельних областей у вигляді фрагментів антитіл, що зв'язують антиген з певною специфічністю і авідності. Маючи в своєму розпорядженні бібліотекою таких експресуються бактеріофагом фрагментів, можна проводити відбір фагових частинок, які продукують той чи інший Fv-фрагмент. Крім того, якщо даними бактеріофагом інфікувати відповідні бактерії, вони починають виділяти Fv-білок у великій кількості у культуральне середовище. Такий підхід не вимагає обов'язкової імунізації тварин або людини.

Моноклональні антитіла представляють собою чітко визначений реагент, але вони не мають більш високу специфічність у порівнянні з поликлональной антисироватки, яка розпізнає антиген в результаті взаємодії імуноглобулінів з його різними епітопи.

Визначення комплементу

Найбільш простий спосіб вимірювання активності комплементу полягає у визначенні концентрації сироватки, викликає гемоліз 50% клітин у стандартному препараті еритроцитів, сенсибілізованих антигеном. Реакцію проводять у пробірках або на мікропланшетах. Для приблизної оцінки активності комплементу більш зручний простий радіальний гемоліз. Цей метод схожий з простій радіальної им-мунодіффузіей, за винятком того що в лунки вносять досліджувану сироватку, а гель містить ЕСА. Навколо лунки, що містить активний комплемент, утворюється зона гемолізу, величина якої пропорційна кількості комплементу в досліджуваній сироватці. Даний метод дозволяє визначати загальну активність компонентів класичного і литического шляхів активації, проте якщо в сироватці виявлено дефіцит комплементу, цим методом неможливо встановити, відсутністю якогось компонента дефіцит зумовлений.

Існують також методи для визначення різних окремих компонентів комплементу за їх утримання чи функціональної активності. Це важлива відмінність, так як компонент може бути присутнім в нормальній кількості, але бути функціонально неактивним. Зміст індивідуальних білків комплементу зазвичай визначають за допомогою радіоіммуноаналіза або ферментного іммуносорбентного аналізу, використовуючи антитіла, специфічні до даного білку. Для вимірювання функціональної активності в суспензію сенсибілізованих еритроцитів вносять всі компоненти комплементу, необхідні для лізису, за винятком досліджуваного білка.

Виділення популяції лімфоцитів

Для проведення багатьох імунологічних досліджень in vivo і in vitro потрібні ті чи інші популяції лімфоцитів. Їх отримують від експериментальних тварин, в основному з тимусу, селезінки і периферичних лімфовузлів. Деякі спеціальні дослідження вимагають виділення клітин з інших ділянок організму, наприклад з пеєрових бляшок. Рециркулирующим клітини можна отримати шляхом канюлірованія грудного лімфатичного протоку і збору клітин протягом кількох годин. У людини найбільш легко виділити лімфоцити периферичної крові, а хірургічним шляхом можна отримати також клітини селезінки, мигдаликів і лімфовузлів. Однак хірургічно відібраний матеріал часто містить інфекційні агенти або пухлинні клітини, залежно від захворювання, яке викликало необхідність хірургічного втручання. Слід мати на увазі, що клітинні популяції, що містяться в перерахованих тканинах, абсолютно різні як за ступенем зрілості лімфоцитів, так і за чисельним співвідношенням в них клітин різних типів.

Тимус є джерелом досить чистою Т-клітинної популяції, проте складові її лімфоцити розрізняються за ступенем зрілості. При роботі з лімфоцитами з інших органів і тканин часто виникає необхідність у виділенні окремих субпопуляцій для аналізу їх особливих функцій. Застосування з цією метою описаного вище проточного флуоресцентного клітинного сортер, що дозволяє розділяти лімфоцити по їх поверхневим маркерами, дозволяє отримувати лише обмежену кількість клітин, оскільки швидкість цитометрії з сортуванням дуже низька. Існує, однак, і ряд методів, що дозволяють виділяти лімфоцити і їх окремі субпопуляції відразу з усього обсягу досліджуваного зразка, - центрифугування в градієнті щільності, розеткоутворення, пеннінг і магнітне розділення.

Виділення в градієнті щільності засноване на тому, що лімфоцити мають меншу щільність, ніж еритроцити і гранулоцити. Цей спосіб дозволяє виділяти більшу частину лімфоцитів крові. Розеткоутворення і пеннінг використовують для виділення субпопуляцій. Пеннінг представляє собою різновид афінної хроматографії стосовно до лімфоцитів. На подібному принципі заснований і спосіб поділу за допомогою магнітних гранул, покритих специфічними антитілами. При змішуванні з клітинами гранули пов'язують ті з них, які розпізнаються фіксованими антитілами. Ці клітини можна потім змити з гранул або виділити шляхом накладення магнітного поля.

Інший спосіб - він застосовується для видалення непотрібної клітинної популяції, - заснований на використанні антитіл і комплементу. Якщо до суміші клітин додати специфічні антитіла, а потім комплемент, клітини відповідної субпопуляції будуть ціалізуватися. Звичайно, для цього методу придатні лише такі антитіла, які пов'язують комплемент; крім того, клітини-мішені повинні нести на поверхні достатню кількість молекул антигену, щоб фіксувати літичну дозу комплементу.

Джерелом певних популяцій лімфоцитів можуть служити Антигенспецифічність Т-клітинні лінії, культивовані протягом тривалого періоду. Отримання таких ліній дозволяє обійтися без частого виділення первинних культур з органів і тканин тварин.

Методи визначення ефекторних клітин

Розроблено різні методи для визначення ефекторних функцій лімфоцитів, зокрема продукції антитіл, цитотоксичності та опосередкованої Т-клітинами допомоги та супресії.

В-клітини, що продукують IgM-або IgG-антитіла, можна визначити за допомогою методу локального гемолізу, або реакції бляшкообразованія. Іншим способом виявлення антітелообразующіх клітин служить імуноферментний тест ELISPOT. Він дозволяє визначати функціонально активні Т-клітини, секретіруюшіе ті чи інші розчинні медіатори, тобто цитокіни. Визначення проводять на підкладці з іммобілізованими антитілами до специфічного цитокіну. Ці антитіла пов'язують даний цитокін, що виділяється Т-клітиною в навколишнє зону, і ефект зв'язування можна виявити шляхом відповідної обробки підкладки: навколо цітокінвиделяющіх Т-клітин будуть видні пофарбовані цятки.

Для визначення антигенспецифічності Т-клітин часто використовують тест стимуляції лімфоцитів - проліферативний відповідь Т-клітин на антиген, що виявляються по включенню ними 3Н-тимідину. Цитотоксичну активність клітинних популяцій зазвичай визначають за їх здатністю лизировать клітини-мішені. Кількісно лізис клітин-мішеней визначають за допомогою тесту з вивільненням міченого хрому.

Міграція лімфоцитів

В експериментах з вивчення міграції лімфоцитів in vivo зазвичай досліджують розподіл в тих чи інших тканинах введених внутрішньовенно мелекул адгезії, мітять лімфоцити або ендотеліальні клітини і використовують блокуючі адгезію антитіла для иммунопреципитации специфічних молекул адгезії.

Спрямована доставка гена

Цей більш тонкий метод на першому етапі полягає в перенесенні гена, який взаємодіє або рекомбінує з досліджуваним ендогенним геном і викликає в результаті його зміна. Наприклад, в цьому ендогенному гені може відбутися делеція, в ньому можуть виникнути точкові мутації або випасти екзон. Такий змінений ген вводять в ембріональну поліпотентної стволову клітку, де він рекомбінує з аналогічним ендогенним геном. Цю стволову клітку переносять потім у бластоцисту або імплантують описаним вище способом

Імунограма – це комплексний аналіз, результатом якого є оцінка стану імунної системи (імунного статусу).В основному матеріалом для дослідження є венозна кров, але в аналізі можуть використовуватися і інші рідини організму (слина, слізний секрет, слиз з носоглотки, спинномозкова рідина).Не рекомендується здавати матеріал для аналізу в період менструації, гострих інфекційних і запальних захворювань.

У процесі дослідження звертається увага на клітинні та гуморальні компоненти імунітету. До клітинних елементів відноситься якісний і кількісний склад лейкоцитів.Для його визначення підраховується кількість моноцитів і гранулярних лейкоцитів (нейтрофілів, еозинофілів і базофілів), а також досліджується їх здатність до знищення патогенних мікроорганізмів (фагоцитозу). Кількість Т-і В-лімфоцитів визначають окремо.До гуморальних елементам імунітету відносяться показники вмісту імуноглобулінів. Їх визначають за допомогою ІФА (імуноферментного аналізу).

Показанням до проведення досліджень є наявність симптомів імунодефіцитного сотояния, а також діагностований вірус імунодефіциту (ВІЛ-інфекція).Первинні імунодефіцити пов’язані з вроженнимі патологіями у виробленні антитіл, вторинні або придбані – із захворюваннями імунної системи, найчастіше онкологічного характеру, прийомом лікарських препаратів, ВІЛ-інфекцією.Імунограму рекомендується зробити і при підозрах на захворювання, які провокують вироблення організмом антитіл проти власних клітин (червоний вовчак, гемолітична анемія, деякі форми цукрового діабету та ін), а також після операцій з пересадки органів і тканин.

Знижена фагоцитарна активність лейкоцитів свідчить про наявність хронічних запальних процесів. Збільшення вмісту специфічних антигенів може говорити про алергічної реакції організму, наявності паразитарних захворювань.За присутності в крові близьких родичів певного виду імуноглобулінів можна судити про генетичну схильність людини до хвороби. Підвищений рівень лімфоцитів свідчить про вірусну патології.Однак підставою для постановки діагнозу може стати тільки наявність виражених симптомів захворювання на тлі свідчень імунограми. При цьому велике значення мають індивідуальні особливості організму і супутні хронічні захворювання.

Імунограма дозволяє виявити порушення в роботі імунної системи організму і вчасно вжити відповідних заходів.Однак відхилення від норми одного показника не є підставою для постановки діагнозу імунодефіциту, тому як вплив на достовірність результатів надають фізичні навантаження і стресові ситуації. Щоб виключити можливість спотворення,слід повторити аналіз через кілька тижнів.

Фундаментальні принципи інтерпретації імунограми

1. Повноцінний клінічний аналіз імунограми може бути проведений лише в комплексі з оцінкою клінічної картини захворювання в певного пацієнта і даних його анамнезу. Робити клінічний висновок на підставі лише імунограми не можна, тому що одні й ті ж зміни показників імунограми можуть спостерігатися при принципово різних патологічних процесах.

2. Комплексний аналіз імунограми більш інформативний, ніж оцінка кожного показника окремо. Однакові зміни певного показника при різних фазах гострого запального процесу можуть однаково розглядатись як сприятлива, так і несприятлива ознака.

3. Реальну інформацію про зміни імунограми мають лише значні порушення показників в імунограмі (40–50 % від норми і більше). У зв'язку з лабільністю показників імунограми їх незначні коливання можливі в цілком здорових осіб.

4. Клінічні дані відіграють вирішальну роль, а імунограма має допоміжне діагностичне і прогностичне значення. Відсутність зсувів в імунограмі за наявності клінічної картини патології вимагає вивчення функції компонентів окремих ланок імунної системи.

5. Аналіз імунограми в динаміці (особливо в зіставленні з клінічною динамікою) більш інформативний з точки зору як діагностики, так і прогнозу перебігу захворювання, сприяє уникненню помилкового трактування.

6. Діагностичне і прогностичне значення мають індивідуальні показники норми в цього пацієнта (з урахуванням віку й наявності супутніх і хронічних захворювань, дії шкідливих факторів, медикаментозної терапії).

7. Першочергове значення при оцінці імунограми має співвідношення показників імунограми, а не їх абсолютні значення.

8. При оцінці показників імунограми слід враховувати можливість їх коливань у зв'язку з прийняттям їжі, фізичними навантаженнями, відчуттям страху, часом доби.

9. Невідповідність зрушень показників імунограми й клінічної картини захворювання (синдром дисоціації) свідчить про несприятливий розвиток процесу.

10. Чим вища антигенність чужорідного фактора й більша зона його проникнення, тим яскравішим буде запальний процес. Отже, тим значніші мають бути і зрушення в імунограмі, що буде свідчити на користь адекватності реакції імунної системи. Відсутність указаних змін лейкограми й імунограми — несприятливий симптом, що свідчить про неадекватність роботи імунної системи. Своєчасне розпізнавання ознак такої невідповідності є головним завданням клініциста-імунолога.

Рівні діагностичного пошуку. Оскільки визначення різних імунологічних показників суттєво різниться за вартістю й діагностичною цінністю, сформовані ІІІ рівні діагностичного пошуку в лабораторній імунології, а всі показники імунітету відповідно до цього згруповано в три групи.

І. Скринінгові дослідження (І рівень):

1. Визначення рівнів Т- і В-лімфоцитів.

2. Визначення рівня природних кілерів.

3. Визначення рівнів сироваткових імуноглобулінів різних класів.

4. Оцінка функціональної активності нейтрофілів (ФЧ, ФІ).

5. Визначення загального титру комплементу.

6. Визначення рівня секреторного IgA.

7. Визначення рівня лізоциму.

ІІ. Розширена імунограма (ІІ рівень):

1. Дослідження окремих субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів.

2. Дослідження окремих функціональних можливостей фагоцитів.

3. Дослідження рівнів окремих компонентів системи комплементу.

ІІІ. Оцінка ефекторної ланки імунітету (ІІІ рівень):

1. Дослідження рівнів окремих цитокінів.

2. Дослідження експресії окремих активаційних молекул.

Структура імунограми. Показники імунограми розподіляють на певні групи залежно від того, яку ланку імунітету вони характеризують.

Систему природженої резистентності характеризують рівень нейтрофілів і моноцитів крові, величина фагоцитарного числа (ФЧ) і фагоцитарного індексу (ФІ), значення НСТ-тесту, рівень природних кілерів, сироватковий титр комплементу, рівень окремих компонентів комплементу, рівень лізоциму в секретах. При цьому ФЧ і ФІ дозволяють оцінити поглинальну активність фагоцитів, а НСТ-тест — інтенсивність «кисневого вибуху», що відбувається всередині фагоцитуючих клітин, тобто характеризує метаболічні процеси.

Клітинну ланку імунітету характеризують вміст CD3+ Т-лімфоцитів (інтегральний показник клітинної ланки), CD4+ Т-лімфоцитів (так званих Т-хелперів), CD8+ Т-лімфоцитів (так званих Т-кілерів, або цитотоксичних Т-лімфоцитів), CD16+-клітин (так званих природних кілерів). Клітинна ланка є переважаючою при вірусних, грибкових патогенах, атипових збудниках (мікоплазми, хламідії), при бактеріальних інфекціях із внутрішньоклітинним перебуванням збудника (мікобактерії), а також при імунній відповіді на пухлини й тканинні форми гельмінтів (наприклад, личинки аскариди або трихінели).

Сьогодні імунологічні лабораторії використовують дві принципово різні методики визначення вмісту різних субпопуляцій Т-лімфоцитів. Перша з них заснована на взаємодії специфічних моноклональних антитіл з відповідними CD-маркерами лімфоцитів, друга — на взаємодії лімфоцитів з еритроцитами барана, внаслідок чого утворюються характерні структури, що отримали назву «розеток». Вважали, що із запровадженням діагностикумів із моноклональних антитіл розеткоутворююча методика відійде в минуле. Однак згодом з'ясувалося, що обидві методики є не конкуруючими, а взаємодоповнюючими.

Визначення рівня субпопуляцій лімфоцитів методом моноклональних антитіл (за CD-маркерами) надає лише кількісну інформацію, однак важливою є не тільки наявність тих чи інших клітин, але і якість виконання ними своїх функцій. При цьому в розеткоутворюючі реакції залучаються переважно активовані Т-лімфоцити, тобто дана методика надає певну інформацію і про функціональний бік імунокомпетентних клітин. Зазначена особливість може пояснювати розходження в показниках субпопуляцій лімфоцитів, визначених за методикою моноклональних антитіл до CD і шляхом розеткоутворення.

Гуморальну ланку імунітету характеризують рівні CD19+, CD20+, CD21+ i CD22+-клітин (В-лімфоцитів у різні фази дозрівання), а також рівні імуноглобулінів різних класів (IgM, IgG, IgE, сироваткового і секреторного IgA). Оскільки синтез антитіл є Т-залежним процесом, для належної оцінки гуморальної ланки імунітету слід враховувати рівень Т-хелперів (СD4+ Т-лімфоцитів), що ще раз підтверджує доцільність комплексного підходу до інтерпретації імунограми. Гуморальна ланка є переважаючою при бактеріальних інфекціях із позаклітинним перебуванням патогену (стрептококи, стафілококи, ешерихії, синьогнійна паличка, протей й ін.), а також при порожнинних протозойних і гельмінтних інвазіях.

IgM — це антитіла гострого періоду імунної відповіді, що синтезуються плазматичними клітинами при першому контакті з певним патогеном. IgM має одразу 10 центрів зв'язування антигенів, що особливо актуально саме в гострий період інфекції, коли існує необхідність у швидкому розпізнаванні й знищенні великої кількості патогену. Цій вимозі відповідає і найсильніша серед усіх імуноглобулінів здатність IgM активувати комплемент, що забезпечує реалізацію комплементзалежної цитотоксичності. У середньому високі концентрації специфічних IgM реєструються з 6–7-го дня після інфікування, пізніше рівень IgM знижується на фоні підвищення вмісту IgG, тобто відбувається переключення з синтезу IgM на IgG. Існує спадкова форма ІДЗ, пов'язана з порушенням переключення ізотипів антитіл. У таких хворих реєструються дуже високі рівні IgM на фоні глибокого дефіциту антитіл інших класів. У клініці це проявляється схильністю до розвитку хронічних інфекцій.

Діагностичне значення високих рівнів специфічних IgM полягає в можливості встановлення факту гострої інфекції, при якій мало місце первинне інфікування певним збудником. Однак слід враховувати, що у хворих на ІДЗ порушується формування імунної пам'яті, у зв'язку з чим можливі випадки, коли при повторному інфікуванні тим самим збудником знову має місце фаза переважної продукції IgM. Зазначена особливість може бути лабораторним критерієм постановки діагнозу ІДЗ.

IgG — це антитіла пізньої фази імунної відповіді, що починають синтезуватись після періоду переважання IgM. У властивостях IgG враховані умови періодів регресу клінічних проявів і реконвалесценції запального процесу, протягом яких кількість патогену зменшується і першочерговим для виліковування є якість розпізнавання антигену. У зв'язку з цим IgG є більш специфічним антитілом, аніж IgM. З іншого боку, у властивостях IgG враховані недоліки IgM, що через великі розміри мають досить обмежену здатність проникати до тканин. Для успішної ерадикації патогену необхідне забезпечення надійного контролю периферичних тканин з боку імуноглобулінів на предмет наявності патогену. IgG, що мають лише 2 центри зв'язування антигену й меншу молекулярну масу, мають кращу здатність проникати до периферичних тканин.

Високі рівні специфічних IgG реєструються в періоди регресу клінічних проявів і реконвалесценції при гострому запальному процесі. Специфічні IgG можуть продукуватися й циркулювати в сироватці крові протягом тривалого терміну після виліковування, оскільки саме цей клас антитіл продукують клітини імунної пам'яті. Вибір IgG для забезпечення імунної пам'яті є невипадковим, оскільки це водночас і найбільш економні, і найбільш специфічні антитіла. Після перенесеної інфекції або має забезпечуватися стабільна концентрація специфічних IgG, або повинно мати місце поступове зниження їх титрів. Зростання титрів специфічних IgG через тривалий термін після перенесеного гострого запального процесу свідчить не про підтримання імунної пам'яті, а про неповне виліковування і хронізацію інфекції, оскільки IgG є антитілами вторинної імунної відповіді, що реалізується при контакті зі вже знайомим антигеном. Отже, при повторній гострій інфекції або загостренні хронічної інфекції фаза переважання IgM відсутня й одразу ж синтезується IgG. Порушення такої закономірності може бути критерієм ІДЗ. Дефіцит IgG найбільш часто проявляється у вигляді хронічних гнійних бронхітів, синуїтів і отитів, що виявлються резистентними до лікування антибіотиками, а також у вигляді гнійничкових захворювань шкіри (пустульоз, фурункульоз, карбункули, абсцеси тощо) з хронічним або рецидивним перебігом.

IgA — це імуноглобуліни слизових оболонок і шкіри. Розрізняють сироваткову і секреторну форми (sIgA). Дефіцит sIgA може бути по'язаний як зі зниженням концентрації сироваткової форми, яка є попередницею секреторної, так і з порушенням діяльності епітелію, де для IgA синтезується секреторний компонент, що захищає молекулу імуноглобуліну від розщеплення травними ферментами. Отже, для адекватної оцінки обміну IgA необхідно проводити паралельне дослідження рівнів його сироваткових і секреторних форм.

sIgA є важливим для підтримання імунної пам'яті слизових і для забезпечення феномену імунної солідарності слизових оболонок. При дефіциті sIgA у клініці відмічається висока схильність до інфекцій (особливо вірусної природи), вхідні ворота яких формуються на слизових оболонках. Часто дефіцит зазначеного імуноглобуліну є причиною хронічного вірусного лімфаденіту й тимомегалії. Крім того, дефіцит sIgA може лежати в основі поєднаних запальних процесів на слизових різних органів (наприклад, хронічного гаймориту й гастродуоденіту), що є результатом порушення підтримання імунної солідарності слизових.

IgE є антитілами другого рівня захисту слизових оболонок. Якщо патоген долає захисний бар'єр sIgA, він розпізнається IgE, які продукуються в мигдаликах, лімфовузлах, солітарних лімфатичних фолікулах, що призводить до дегрануляції тучних клітин і розвитку запалення слизової оболонки. Іншими словами, механізм, пов'язаний з діяльністю IgE, є альтернативою нейтралізуючому ефекту sIgA. Крім того, IgE відіграють ключову роль в антипротозойному й протигельмінтному імунітеті. Погану репутацію у клініцистів IgE здобули завдяки участі в атопічних реакціях.

IgD — імуноглобуліни з поки що до кінця не встановленою функцією.

Оцінка ефекторної ланки імунної відповіді. Ефекторною називається кінцева власне пошкоджуюча ланка імунної відповіді. Ефекторні ланки клітинної і гуморальної відповіді різняться між собою. Для оцінки ефекторної ланки клітинного імунітету визначають вміст великих гранулярних лімфоцитів (ВГЛ) — популяції клітин, до складу якої входять природні кілери й цитотоксичні Т-лімфоцити. Вміст ВГЛ характеризує кількісний бік ефекторної ланки імунної відповіді за клітинним типом. Більш повну інформацію можна отримати при паралельному визначенні цитотоксичності мононуклеарів, що є якісним показником. Під мононуклеарами розуміють макрофаги, природні кілери і цитотоксичні Т-лімфоцити. Ефекторною ланкою гуморальної імунної відповіді є синтез антитіл (мова йде про нейтралізуючі антитіла) і фагоцитоз, за рахунок якого знешкоджуються сформовані імунні комплекси.

Функціональні показники імунограми. Усі показники імунограми можна поділити на якісні й кількісні. Досі мова йшла переважно про кількісні показники. До якісних показників належать реакції бласттрансформації Т- і В-лімфоцитів. Дані зазначених досліджень дозволяють оцінити проліферативний потенціал імунокомпетентних клітин і виявити дефекти імунітету, пов'язані з недостатньо інтенсивним розмноженням лімфоцитів. Для індукції РБТЛ використовують спеціальні речовини, що викликають мітоз лімфоцитів. Такі речовини отримали назву мітогенів. Мітогени Т- і В-лімфоцитів різняться між собою. Так, як мітогени для Т-лімфоцитів виступають фітогемаглютинін (ФГА) і конканавалін А (Кон-А), а для В-клітин — ліпополісахариди бактерій. На практиці вивчають спонтанну проліферантивну активність імунокомпетентних клітин й індуковану мітогенами. За рахунок оцінки отриманої різниці роблять непрямий висновок про проліферативну мобільність лімфоцитів — оперативність залучення до процесів ділення у разі імунної реакції.

Також для оцінки функціональної здатності лімфоцитів визначають кількість клітин, що експресують адгезійні молекули (зокрема, ІСАМ-1, або СD54). Крім того, можливе вимірювання рівнів лімфоцитів за методом розеткоутворення (Е-РУК), за яким визначаються переважно активовані, залучені до імунної відповіді клітини. Функціональну характеристику надають також дослідження рівнів тих чи інших цитокінів (медіаторів імунної відповіді) у плазмі крові.

Комплекс показників вмісту різних цитокінів хворого складає його цитокіновий профіль. Рівні ІЛ-1β, ФНП-α, ІЛ-8, ГМ-КСФ характеризують функціональну активність клітин природженої резистентності, вміст ІЛ-2, ІФН-γ, ФНП-β свідчить про функціональну активність Т-хелперів 1-го типу, а вміст цитокінів ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6 — про діяльність Т-хелперів 2-го типу. Цитокіни ІЛ-10 і ТФР-β мають антизапальні властивості, їх переважна продукція спостерігається в завершальній фазі імунної відповіді.

Імунорегуляторний індекс. Досить часто до складу імунограми включають так званий імунорегуляторний індекс, що є співвідношенням рівнів CD4+ до CD8+ Т-лімфоцитів. Раніше вважали, що до складу субпопуляції CD8+ Т-лімфоцитів відносяться так звані клітини-супресори, що пригнічують імунну відповідь. Сьогодні встановлено, що окремої субпопуляції супресорів не існує, а СD8+ Т-лімфоцити наділені цитотоксичними властивостями (клітини-кілери). У зв'язку з цим змінилося розуміння значення імунорегуляторного індексу.

Сьогодні рівень імунорегуляторного індексу оцінюють у зіставленні з фазою імунної відповіді. У період розпалу і стихання клінічних проявів імунорегуляторний індекс сягає високих значень за рахунок великого відсоткового вмісту Т-хелперів (CD4+ Т-клітин). У період реконвалесценції значення показника зменшується у зв'язку з наростанням рівня CD8+ Т-клітин (кілерів). Порушення такої закономірності свідчить про неадекватність імунної реакції та про можливість хронізації інфекції через неповну ерадикацію збудника.

Оцінка апоптозу. Одним із механізмів формування імунного дефекту є патологічний апоптоз імунокомпетентних клітин. Для виявлення підвищеної готовності лімфоцитів до апоптозу (стану, що передує запрограмованій загибелі імуноцитів) проводять визначення рівнів клітин, які експресують рецептори до апоптозу (зокрема, рецептор Fas, або CD95). Фазу безпосередньої реалізації патологічного апоптозу визначають за зниженням рівнів лімфоцитів на фоні клінічно незавершеного патологічного процесу або за зменшенням рівнів зрілих Т-лімфоцитів (СD3+, СD4+, CD8+ Т-клітин) на фоні підвищення рівня нульових лімфоцитів (при цьому лімфопенії може й не бути). Паралельно зазвичай фіксуються зниження рівня прозапальних лімфоцитарних цитокінів і підвищення вмісту антизапальних факторів, зокрема ІЛ-10, що має компенсаторний характер. Дослідження апоптозу є дуже важливим, оскільки неадекватна запрограмована загибель імуноцитів є одним із механізмів формування ІДЗ.

Оцінка схильності до автоімунних реакцій. Окрему групу в імунограмі складають показники, що характеризують автоімунну налаштованість імунної відповіді. В умовах імунних дефектів порушується реалізація всіх функцій імунної системи, у тому числі здатності до підтримання імунної толерантності. Наслідком цього є посилення автоімунного компонента імунної відповіді у хворих на ІДЗ. Про зазначену тенденцію може свідчити підвищення вмісту циркулюючих імунних комплексів, зростання рівнів автоантитіл (наприклад, ревматоїдний фактор, проти основного білка мієліна, антинуклеарних тощо), посилення автосенсибілізації нейтрофілів та деякі інші показники.

Умови сьогодення вимагають від будь-якого клініциста фундаментальних знань принципів інтерпретації імунологічних досліджень, без проведення яких обстеження пацієнтів у багатьох випадках є неповним. Адекватна інтерпретація лейко- та імунограми — запорука правильного діагнозу й ефективної терапії різноманітної імунозалежної патології, що часто зустрічається в різних галузях клінічної медицини. Ми сподіваємось, що дана публікація відповіла на цілу низку питань, які становили великий інтерес для широкого кола практикуючих лікарів.