III Молекулярно-генетические методы диагностики

Выявить возбудителей иерсиниоза можно методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе метода лежит амплификация (увеличение числа копий) специфического участка ДНК возбудителя за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с использованием фермента ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов. Благодаря высокой специфичности и чувствительности ПЦР широко внедряется в практику как недорогой и технически несложный экспресс-метод анализа и диагностики. Материалы для ПЦР анализа доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день. Допускается хранение материала при минус 20°С в течение 30 сут.

Уникальные возможности открывает метод иммуноблотинга. В настоящее время имеются отдельные работы по лабораторному изучению его эффективности при инфекциях, обусловленных иерсиниями. Метод иммуноблотинга эффективен для дифференциальной диагностики бруцеллезной инфекции и иерсиниоза, обусловленного серотипом О:9.

Принцип метода представляет собой подход к анализу белков, сочетающий в себе преимущества трех независимых физико-химических методов исследования. На первом этапе происходит разделение БНМ бактериальной культуры с помощью электрофореза в полиакриламидный гель. Затем проводят электрофоретический перенос (электроблотинг) разделенных белков из геля на твердую подложку (нитроцеллюлозу). Перенесенные белковые антигены выявляют на полученной таким образом реплике (блоте) с помощью ИФА. Результатом реакции служит проявление полос коричневого цвета, отвечающих местоположению БНМ иерсиний и бруцелл. Данный метод позволяет дифференцировать иерсиниозную инфекцию, обусловленную серотипом О:9, от бруцеллеза при исследовании сывороток крови людей и животных.

IV Серологические методы

В целях выявления антител к иерсиниям используют реакцию агглютинации (РА), реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА,РПГА), реакцию коагглютинации (РКА), латексагглютинации (РАЛ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию связывания комплемента (РСК).

Антитела к возбудителю псевдотуберкулеза появляются в крови уже на 1-й неделе болезни, а существенное повышение их уровней происходит к началу 3-й недели. Через 2 месяца наблюдается снижение концентрации антител и к 6-месячному сроку они могут обнаруживаться в минимальных значениях (1:50, 1:100). Наиболее выраженная динамика антителообразования наблюдается у больных с течением болезни средней тяжести. В отдельных случаях с поражением ряда органов за весь период заболевания "диагностические" титры антител выявить не удается, в том числе у больных с бактериологическим подтверждением диагноза.

При заболеваниях, обусловленных Y.enterocolitica, характер иммунного ответа в значительной степени зависит от тяжести и клинической формы болезни. Высокие титры антител (до 1:6400) обнаруживаются при желтушной, артралгической и септической формах инфекции. При легком течении, особенно при гастроэнтероколитической форме, динамика антител выражена слабо и титры нередко приближаются к уровню диагностических (1:160 — 1:200) и начинают регистрироваться только со 2-й недели заболевания. Многочисленными наблюдениями доказано наличие перекрестно реагирующих антител у иерсиний как внутриродовых, так и взаимодействующих с рядом энтеробактерий, имеющих общие антигены. Однако на пике инфекционного процесса уровень видо- и серо-типоспецифических антител, как правило, значительно превышает уровень гетерологичных антител. Этим обусловлен учет минимального диагностического титра, который равен 1:160—1:200. Достоверным считается 2—4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток. Для исследования парных сывороток кровь забирают в первые дни болезни (1-3-й), а повторно – на 7-10-й день.

РА с набором типовых штаммов (живых и убитых) в настоящее время получила широкое применение в результате использования стандартных антигенов Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica вирулентных серо- и биотипов. При параллельной постановке РА с антигенами иерсиний различных видов, серо- и биотипов и бруцелл возможно выявление антител в высоких титрах к двум или нескольким агентам. Для дифференциации специфического иммунного ответа, возникшего в остром периоде болезни, от имеющихся в сыворотке крови фоновых антител успешно применяется определение количественного содержания иммуноглобулинов классов М и G с помощью ИФА.

ИФА основан на образовании комплекса антиген-антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена (конъюгат). При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по окрашенному продукту. Интенсивность реакции учитывают с помощью спектрофотометра при длине волны 492 нм; возможна визуальная оценка реакции.

В остром периоде преобладают IgМ; к концу 1-го месяца от начала заболевания они сменяются на IgG. Следовательно, обнаружение специфических IgМ-антител при однократном исследовании проб крови может с большей долей вероятности подтвердить клинический диагноз.

Наибольшие трудности представляет дифференциация иерсиниоза, обусловленного серотипом О:9, от бруцеллеза, связанная с выраженным антигенным родством их возбудителей. В таких случаях, помимо постановки серологических реакций Райта, Хеддльсона с бенгальским розовым на бруцеллезную инфекцию, перспективно применение методов дифференциации иерсиниозных и бруцеллезных антител по классам иммуноглобулинов в ИФА и в иммуноблотинге.

РНГА остается наиболее распространенным методом серологической диагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза. Поскольку имеется минимальный набор диагностикумов (к Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica О:3 и О:9) для РНГА, которые представляют собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов, целесообразна также постановка РА, выявляющая антитела к корпускулярным антигенам.

Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены серотипов: О:3; О:4,32; О:4,33; О:5; О:5,27; О:6,30; О:7,8; О:8; О:9 и псевдотуберкулезные — серотипов 1—3.

В перечисленных выше реакциях используемые диагностические препараты для выявления специфических антител получают, как правило, либо из корпускулярного антигена, приготовленного к цельным микробным клеткам (РА), либо субъединичного (к ЛПС- компонентам) — РНГА, РСК.

В последние годы привлечено внимание к РСК. Принцип метода основан на образовании комплекса антиген—антитело, при котором происходит адсорбция комплемента. Для выявления адсорбции (связывания) комплемента вводят индикаторную гемолитическую систему — эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической антисывороткой кролика. При внесении сенсибилизированных эритроцитов в пробирку с исследуемой сывороткой, антигеном и комплементом гемолиз происходит только при наличии свободного комплемента (реакция отрицательная). При адсорбции комплемента на системе антиген—антитело гемолиза не происходит (реакция положительная).

Оптимальным сроком обследования больных с помощью РНГА, ИФА и РКА следует считать 1-ю неделю болезни. При применении РКА оптимально исследование трех видов материала (фекалии, слюна, моча), ИФА — фекалий и мочи.

На 2-й неделе обследования больных наиболее эффективно определение специфических антител к Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica распространенных сероваров в РА, определение антигенов Y.pseudotuberculosis в копрофильтратах методом ИФА.

На 3—4-й неделе — исследование сыворотки крови в РА и/или РСК.

Недостатками серологических методов исследования являются низкая частота подтверждения клинического диагноза, ретроспективность (диагноз подтверждается лишь на 3-4-й неделях болезни) и неприменимость у больных с выраженными иммунодефицитами.

Схема оптимального применения приведенных методов при обследовании больных с острым аппендицитом предполагаемой иерсиниозной этиологии имеет некоторые особенности. Обследование проводится при наличии у больных трех и более клинических признаков:

• пальпируется болезненная слепая кишка,

• диспепсические явления,

• развитие острого аппендицита в процессе наблюдения,

• лейкоцитоз выше 9,0-10⁹/_л,

• несоответствие пульса температуре тела,

• сомнительные симптомы раздражения брюшины.

Обследование также показано при нетипичном течении послеоперационного периода.

Тактика лабораторного обследования следующая:

а) до операции: исследование кала и слюны в РКА и ИФА;

б) если до операции забор указанных проб не производился, то исследуют червеобразный отросток и выпот из брюшной полости в ИФА, а при отрицательных результатах — сыворотку крови в РА и кал в ИФА (забор материала не ранее 3—4-х суток послеоперационного периода).

В диагностических целях при отрицательных результатах бактериологических, иммунологических и серологических методов исследования можно использовать  аллергодиагностические препараты "псевдотуберкулин" и "энтероиерсин". Они предназначены для постановки внутрикожной аллергической пробы или пробирочного теста ППН (показатель повреждения нейтрофилов) в реакции иммунолейкоцитолиза, РБТЛ и РТМЛ, позволяющих быстро и просто выявить сенсибилизацию организма к белкам иерсиний с первой недели болезни и в течение нескольких лет после нее. Образование через 24-28 часов в месте введения 0,1 мл аллергена папулы и покраснения диаметром 10 мм и более является положительным результатом кожной аллергической пробы.