Лабораторная диагностика

I Бактериологическое исследование

Целью бактериологического исследования материала на иерсиниоз является выделение чистой культуры возбудителя болезни с изучением ее морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных свойств и определением ее патогенности в пластинчатой РА с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки к патогенным штаммам иерсиний.

С учетом особенностей биологических свойств Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica, выраженности их патогенных свойств при определенной температуре инкубации посевов исследования материала от больных проводят однотипно. Селективная ценность низких температур дала возможность предложить метод выделения иерсиний путем выращивания посевов при температуре +4°С, так называемое "холодовое обогащение". В основе этого метода лежит способность иерсиний размножаться, в то время как другие микроорганизмы в этих условиях не растут вовсе или очень слабо. Применение этого метода значительно улучшило лабораторную диагностику иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Одним из важных условий качественного проведения бактериологического исследования являются правильный сбор материала и его подготовка к исследованию. Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3—5 дней болезни и до назначения антибиотиков.

От практически здоровых людей в очагах берут на исследование испражнения, мочу, а при наличии изменений в зеве - слизь с задней стенки глотки. Для успешного исследования испражнения лучше брать при естественной дефекации из последних порций. У работников пищеблока исследуют смывы с рук.

От больных берут различный материал: в первые дни заболевания, при наличии изменения в зеве - участок со слизистой глотки. У всех больных независимо от сроков заболевания - испражнения, мочу, кровь. При соответствующей клинике исследуют ликвор, мокроту, желчь, при оперативных вмешательствах мезентериальные лимфатические узлы или измененные части кишечника и аппендикса, гной из абсцессов; от трупа человека - патологически измененные участки органов: лимфоузлы, участки тонкого кишечника, кусочки печени, селезенки, сердца.

Мазок со слизистой зева берут обычным чуть влажным ватным тампоном, с задней стенки глотки, корня языка. Испражнения (1-2г) после естественной дефекации берут из горшка, судна или пеленки, используя для этого стеклянные трубки, палочки, алюминиевые петли. Взятый материал (из зева и испражнения) немедленно опускают в пробирки со средой накопления и до отправки в лабораторию сохраняют в холодильнике. Мочу, взятую утром, помещают в среду накопления в соотношении 1:1. В том же соотношении помещают в среду желчь.

При отсутствии среды накопления испражнения, мочу, желчь можно помещать в стерильные стеклянные емкости. Ликвор, участки кишечника, лимфатические узлы, резецированные при операции, патологоанатомический материал помещают в стерильные стеклянные емкости. Кровь берут из вены 3-5 мл в стерильные пробирки.

В лаборатории из пробирок извлекают трубки и тампоны. Если соотношение испражнений и среды нарушены (много испражнений) или они доставлены без среды накопления, материал пересеивают в новую пробирку в соотношении 1:10. Мочу, если она доставлена в стеклянных емкостях, засевают 1:1 в среду накопления. Можно мочу профильтровать через стерильный ватный тампон, который затем поместить в среду накопления.

Пробирки с кровью ставят в термостат на 1 час, затем отделяют сгусток от стенок петлей и помещают в холодильник на 18-20 часов. Сыворотку крови используют для серологического исследования. Сгусток крови заливают питательным бульоном (1:1) и измельчают. Ликвор в том же соотношении заливают бульоном.

Органы перед посевом измельчают и помещают в среду накопления в соотношении 1:10.

Для ускорения выделения иерсиний целесообразно часть первичного материала обработать низкой температурой сразу. Пробирки с испражнениями и мочой больных, смывы с предметов, взятых в пищеблоках, пробы готовых блюд, а также органы и испражнения животных (содержание теплолюбивую флору), помещают в холодильники при температуре минус 20-30°С на 30 мин - 1 час или в морозильную камеру бытового холодильника (температура минус 10-15°С) на 18-24 часа. После этого пробирки переносят в холодильник при температуре +6 - +12,°С на 4 часа (для предотвращения растрескивания пробирок), затем помещает в термостат при температуре 22-25°С на 18-24 часа.

Посев материала производят в пробирки с 5 мл. жидкой среды обогащения, встряхивают, ставят в холодильник и выдерживают в ней до высева иерсиний, но не более 10 дней.

Для "холодового обогащения" используют жидкие среды накопления: фосфатно-буферную, И-бульон (содержит коммерческую селективную добавку для иерсиний - цефсулодин-иргасан-новобиоцин), буферно-казеиново-дрожжевую (БКД), 1% забуференную пептонную (ЗПС). Затем производят пересев на одну из плотных дифференциально-диагностических или селективных сред, разлитую в чашки Петри и подсушенную в течение 40-60 мин в термостате: И-агар (цефсулодин-иргасан-новобиоциновую среду), селективные среды для выделения иерсиний компании "HiMedia Laboratories Limited" или фирмы "OXOID", агар Эндо, среду с желчью и индикатором бромтимоловым синим (СБТС), среду для выделения иерсиний (г. Махачкала), агар Мак-Конки, ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар (КЛД-агар).

Для повышения высеваемости целесообразно материал, подрощенный в холодильнике подвергнуть щелочной обработке для ингибиции посторонней флоры. Этот прием основан на относительной резистентности к щелочи иерсиний и чувствительности других энтеробактерий.

Выделение культур иерсиний.

 Культуры, полученные в жидкой среде накопления, через 24 часа пересевают бактериологической петлей частыми широкими штрихами в отдельные чашки Петри с одной из плотных питательных сред по всей поверхности агара или на отдельные секторы чашек, которые помещают в термостат на 24-48 ч. Посевы производят петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают.

 Через 24-48 ч учитывают характер роста колоний, выросших в чашках Петри на поверхности одной из плотных питательных сред, визуально и с помощью лупы.

Таблица 7

Характер роста Y.enterocolitica и Y. pseudotuberculosis на

различных плотных питательных средах

Питательная среда	Характеристика колоний через 48 ч роста
Селективный И-агар	Y.enterocolitica Колонии диаметром 0,8-1,5 мм, бесцветные, округлые, матовые, с темно-красным бугорком в центре. Края колоний с небольшими неровностями. Цвет среды остается розовым
Среда для выделения иерсиний (г. Махачкала)	Y.enterocolitica Колонии диаметром 0,5-1,5 мм, бледно-розовые с сиреневым оттенком, круглые, блестящие, выпуклые. Цвет среды остается светло-коричневым.
Среда с желчью и бромтимоловым синим (СБТС)	Y.enterocolitica Колонии диаметром 2-4 мм, темно-оливкового цвета, более светлые к периферии, сильно шероховатые, с выпуклым более темным центром, края изрезанные, фестончатые. Темно-зеленая с бирюзовым оттенком среда вокруг колоний обесцвечивается и приобретает оливковый цвет - более светлый, чем основной фон. Y. pseudotuberculosis Колонии диаметром 1-2 мм, голубоватого цвета, с приподнятым центром и суховатой матовой поверхностью, края изрезанные, фестончатые. Колонии других энтеробактерий выпуклые или плоские, сочные, округлой формы, более крупные, коричневого или желтого цвета.
Агар Эндо	Y.enterocolitica Колонии диаметром 1,0-1,5 мм, округлые. Периферическая часть колоний розовая, блестящая, прозрачная. Центр колоний выпуклый шероховатый, окрашен в темно-розовый цвет. Y. pseudotuberculosis Колонии диаметром 1,0-1,5 мм, крупные, выпуклые, округлые, блестящие с ровными краями, бесцветные. Среда краснеет, но на участках массивного роста иерсиний бледно-розовая.

 Пересев с первичной среды накопления, если не выделилась культура, повторяют на 3,5,7 и 10-е сутки. Если в ходе бактериологических посевов материала от больных обработка проб К₂НРО₄ не строго обязательна, то перед последним сроком высева материала она важна.

 Селективные и дифференциально-диагностические среды для выделения иерсинии подавляют рост многих видов посторонней микрофлоры, однако это обстоятельство не исключает необходимость идентификации культур бактерий, подозрительных на иерсинии, по биохимическим свойствам.

 Производят отсев на мочевину (среда Олькеницкого) и маннит. Этот этап необходим для первичной идентификации. Отсутствие через сутки ферментации маннита и положительная реакция на мочевину позволяют исключить Proteus vulgaris, Mirabilis morganii, Alcaligenes fecalis. Для дальнейшей идентификации берут культуры бактерий, обладающие уреазной активностью (малиновое окрашивание на среде Олькеницкого) и ферментирующие маннит до кислоты.