4. Устойчивость.

Бруцеллы малоустойчивы к действию различных физических и химических факторов. Агаровые культуры в запарафинированных пробирках сохраняются несколько недель, лиофильно высушенные – годами. Прямые солнечные лучи убивают их через 1,5 - 4,5 часа. В воде бруцеллы выживают и более 5 месяцев, в поверхностном слое почвы – 40 суток, на глубине 5…8см – до 3 месяцев, в навозе при медленном высушивании – до 120 суток, в моче коров – до 4 суток, в почве зимой – 4…5суток, в высушенных плодных оболочках – до 120суток. В охлажденном молоке сохраняются 6…8суток, в кислом молоке – 1…4, в масле – 40…60, в сырах – более 42, в брынзе (5…11%-й раствор поваренной соли) – 45…60, в замороженном мясе – свыше 320 суток, в засоленных шкурах – 2мес, в шерсти – до 3…4мес. [9]

При температуре 60°С бруцеллы погибают через 30 мин, при 80…85°С – через 5 мин, при 100°С – мгновенно. Пастеризацию молока проводят при 85…90°С 30 мин.

Дезинфицирующие растворы – 2%-й фенол, 1%-й креолин, 0,5%-й лизол, 1…2%-й формалин, 0,5…1%-й хлорамин, 1%-я соляная кислота, 3%-й гидроксид натрия, 5%-я хлорная известь убивают бруцелл в течение нескольких минут. [5]

5. Патогенез.

Не зависимо от места внедрения в организм бруцеллы распространяются по лимфатическим путям, и задерживаются в регионарных лимфатических узлах, где размножаются, затем проникают в кровяное русло и попадают в паренхиматозные органы. Бруцеллы – внутриклеточные паразиты, обитающие в клетках лимфоидно-макрофагальной системы. В местах их размножения образуются специфические гранулемы. При обострении процесса бруцеллы из клеток вновь проникают в кровь, вызывая различной интенсивности бактериемию и рецидив. В результате гибели бруцелл происходит освобождение эндотоксина, который обуславливает соответствующую симпатику острого и хронического бруцеллёза[9]

Плодные оболочки многих животных содержат эритриол – фактор роста для бруцелл. Этим можно объяснить особенно высокую восприимчивость к инфекции беременных животных.

В патогенезе бруцеллёза определённое значение имеют L – формулы бруцелл, которые длительное время персистируют в организме. При хроническом процессе от животных выделяли культуры бруцелл стабильных L – форм. Бруцеллёз животных преимущественно протекает бессимптомно. [5]

6. Изменчивость.

Изменчивость присуща материи вообще; Изменчивость материи явилась причиной возникновения белка, а из него живой первичной клетки, в том числе и микробной.

В силу своей высокой размножаемости и краткого цикла развития, микроорганизмы весьма адаптивны и вариабельны.

Воздействуя на микробную клетку изменёнными условиями внешней среды, иногда резко отличными от обычного существования, можно заставить бактерии изменить тип ассимиляции и, таким образом, получить новые расы микроорганизмов, резко отличающихся от исходной формы.

Среда микроорганизма животных, биоценоз в условиях сожительства разных видов микроорганизмов, питание одного вида продуктами жизнедеятельности другого, - всё это являются важнейшими факторами изменчивости и эволюции микробов.

К этой же категории мощных факторов изменчивости микробов относятся физические воздействия как то: влияние солнечной энергии или отдельных элементов его спектра.

Для получения наследственных рас бруцелл пониженной вирулентности используют биологические и физические методы воздействия на бруцеллёзную клетку. Из физических методов используются ультракороткие волны (УВЧ).

Бруцеллы адаптируясь в организме, изменяют свои культуральные, морфологические и биологические свойства и из организма могут быть выделены в своей исходной форме лишь в редких случаях. Из организма высевают два типа колоний: первый тип колоний (1/в), возникает на искусственной среде, а второй (2/в) морфологически сходный с первым позже.[3]

Полученные варианты по своим культуральным и морфологическим признакам отличались от типичных бруцелл. Серологически они вели себя также различно; - бактерии типа 2/в агглютинировались, а типа 1/в не агглютинировались бруцеллёзной сывороткой. Чем длительнее происходило пассажирование бруцелл в организм, тем чаще и в большом количестве обнаруживались колонии бактерии типа 1/в – не агглютинирующиеся бруцеллёзной сывороткой.

Выращивание бруцелл на продуктах жизнедеятельности бактерий типа 1/в (в целом и разведённом фильтрате) показывает, что продукты обмена не обладают ни бактерицидными, ни бактериостатическими свойствами по отношению к бруцеллам. Наоборот, в присутствие продуктов метаболизма рост вирулентных бруцелл возникает значительно раньше и интенсивнее, чем в обычной среде, что указывает на стимулирующие свойства этих продуктов.

Бруцеллы, выращенные на продуктах обмена бактерий типа 1/в, по своим культуральным и морфологическим свойствам становятся сходными с последними, но серологические их свойства остаются прежними.

При посеве бруцелл в убитую культуру бактерии типа 1/в, в зависимости от длительности выращивания на убитых телах, изменяют свою агглютинабильность. Резкие скачки в сторону повышения агглютинабильности бруцелл на III и V декаде завершались прогрессивным снижением.

При посевах культуры на VI и VII декаде выращивания возникает два типа колоний: - сохранивший специфические свойства в отношение бруцеллёзной сыворотки (М/в), и второй тип (М/к) – потерявший эти свойства. Колонии обоих типов оказались термолабильными. Одновременно с потерей типоспецифических свойств, бактерий типа М/к утрачивают вирулентность для мышей.

Несмотря на то, что бактерии М/к принадлежали к «R»-форме, что по Хеддльсону характеризуется потерей антигенности.

Культура М/к после пятидесяти пересевов на искусственных средах и последующих пассажах не изменяла свои биологические свойства, а затем спустя 4 месяца хранения, снова стала агглютинироваться бруцеллёзной сывороткой. Однако, возврат типоспецифических свойств у вариантов бруцелл типа М/к не повлёк за собой восстановления патогенности.

Противоположные результаты получают при совместном выращивании бруцелл и живых бактерий типа 1/в. Спустя 24 часа совместного выращивания при посеве на чашки Петри, бруцеллы не вырастали, даже одна петля бульонной культуры бактерий типа 1/в была способна через 48 часов предотвратить рост бруцелл любой М – концентрации. Установлено, что длительные пассажи бактерий типа 1/в в условиях совместного выращивания с бруцеллами усиливают антагонистические свойства первых. [3]

Питание одного вида продуктами жизнедеятельности или распада другого вида - является важнейшим фактором изменчивости и эволюции микробов. Лучистая энергия так же оказывает значительное влияние на характер эволюции микробов.

Известно, что у молодых микроорганизмов процессы ассимиляции значительно интенсивнее; кроме того, они весьма чувствительны к различным внешним факторам.

В первую генерацию облучения наблюдается резко выраженная стимуляция роста бруцелл. Дальнейшее облучение показывает, что не все особи бактериальной популяции бруцелл смогли адоптироваться в условиях повышенной функциональной жизнедеятельности. Большинство из них погибла, или заканчивая свой жизненный цикл, оставляли не вполне жизнеспособное потомство. Наиболее пластичные формы бруцелл адаптировались к условиям интенсивной жизнедеятельности и закрепляли вновь приобретённые свойства в поколениях.

Академик Лысенко, развивая учение Мичурина, говорил, что причиной изменчивости живого тела является, изменение типа ассимиляции – типа обмена веществ. [3]

lll. Лабораторная диагностика заболевания.

Диагностика этой болезни основывается на показаниях результатов серологических, бактериологических, а также аллергических методов исследования (с учётом клинических признаков болезни – аборты, бурситы, орхиты, эпидидимиты, эндометриты). [6]

а) Патологический материал.

Для бактериологического исследования на бруцеллёз ( при жизни животного) в лабораторию направляют: абортированный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей, желудок плода, перевязанный с двух концов лигатурой, кусочки печени и селезёнки плода. Молоко берут от коров в стерильные пробирки по 10 – 15мл из каждой доли вымени (последние порции), у овец и коз – путём пункции цистерны вымени посредством стерильного шприца с иглой. Для исследования молоко отсылают свежим (в день взятия пробы); если это представляется возможным, то его консервируют(лучше сухой борной кислотой из расчета 0,1г на 10мл молока).При убое самцов (баранов и др.)исследуют пораженные ткани органов – семенники с придатками. [8]

Тканевой материал от каждого животного в отдельности упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, затем помещают в водонепроницаемую тару (полиэтиленовый пакет, ящик, банку). Патологический материал отправляют в свежем виде или консервированным 30%-ным стерильным водным раствором химически чистого глицерина в соотношении 1: 4 (1:5). От абортировавших животных (не ранее чем через неделю после аборта) обязательно исследуют кровь.

В лабораторию материал доставляют с нарочным и с сопроводительным письмом.

б) бактериологическая диагностика.

Проводится по общепринятому принципу – микроскопия, высев на питательные среды для выделения и изучения чистой культуры, биопроба (заражение морских свинок).

1.Микроскопия. Из каждой пробы патматериала готовят два мазка-отпечатка из тканей органов или два мазка из жидкого материала (истечения), высушивают, фиксируют пламенем. Один препарат окрашивают по грамму, другой – специальным методом (по Козловскому, Шуляку – Шину или Стампу). Мазки, приготовленные из осадка молока (сливок), после центрифугирования перед окраской следует обезжирить смесью Никифорова.

Для выявления бруцелл непосредственно в патологическом материале, а также в объектах окружающей среды предложен прямой метод иммунофлюоресценции (РИФ); непрямой метод позволяет обнаружить антитела в сыворотке крови больных, переболевших или вакцинированных животных.

Бруцеллы – мелкие, палочко - или кокковидной формы бактерии, длиной 0,6 – 1,5 мкм, в диаметре – 0,3 – 0,5 мкм; неподвижные, спор не образуют, располагаются в мазке изолированно, попарно или небольшими скоплениями, кучками. Грамотрицательные. [9]

2. Для выделения бруцелл делают посевы на специальные питательные среды: мясо-пептонный печёночны бульон (МППБ) и мясо-пептонный печёночный агар (МППА) с глицерином и глюкозой с добавлением генцианвиолета (1:2000000) или ацетата натрия (0,125 мг/мл), печёночно-глюкозно-глицериновый агар и бульон (ПГГА, ПГГБ), картофельный агар, эритрит агар или сывороточно-декстрозный агар. [8]

Изучение сроков появления роста. Рост бруцелл проявляется через 7-10-30 и даже 40 дней. По мере адаптации к питательным средам рост культуры может появиться на 2 – 3-й день. На плотных питательных средах рост бруцелл проявляется мелкими прозрачными выпуклыми, округлыми, блестящими колониями с гладкой (S-формы) поверхностью с голубоватым оттенком (встречаются и R-формы). При более длительном культивировании колонии мутнеют, с появлением пигмента – темнеют, сливаются. В жидких питательных средах рост бруцелл проявляется в начале равномерным помутнением и образованием пристеночного кольца голубоватого оттенка; В последствии образуется незначительный осадок. При обнаружении роста из типичных колоний готовят мазки, окрашивают специальными методами и просматривают под микроскопом. Затем пересевают на плотную питательную среду и культивируют при тех же условиях.

Кроме того ставят РА на предметном стекле с позитивной бруцеллёзной сывороткой, разведённой 1:50 и 1:2 (для выявления слабоагглютинирующих культур ). Первичную культуру Br. ovis надлежит подвергнуть серологической идентификации – чистой выделенной культурой гипериммунизируют кроликов, затем их сыворотку исследуют в РДСК с антигеном Br. ovis (овисный антиген)

Культуры бактерии, обладающие типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами, дающими положительную РА с позитивной бруцеллёзной сывороткой, относят к бруцеллам. [8]

Для дифференциации видов бруцелл используют чистые культуры (в S-форме). Бруцеллы дифференцируют по способности роста в отсутствии повышенной концентрации СО2, Выделению HS2, чувствительности к фагу Тб, бактериостатическому действию анилиновых красителей и агглютинации моноспецифическими сывороткам.

Таблица 1

Вид бруцелл	Потребность в СО2	Образование Н2S	Рост в средах с красителями		Агглютинация моноспецифическими сыворотками.			Лизис фагом Тб
			Основной фуксин (1:50000)	Тионин (1:25000)
					А	М	Р
B.melitensis	-	-	+	-	-	+	-	-
B.abortus	+	+	+	-	+	-	-	+
B.suis	-	+	-	+	+	-	-	-
B.ovis	+	-	+	+	-	-	+	-
B.neotomae	-	+	-	-	+	-	-	-
B.canis	-	-	-	+	-	-	+	-

Примечание. «+» - интенсивный рост; «-» - отрицательный рост.

Серологическая диагностика. Для серологического исследования направляют кровь или сыворотку крови и молоко.

Применяют пробирочную реакцию агглютинации (РА), реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), пластинчатую реакцию агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и кольцевую с молоком (КР). [8]

РА ставят в объёме 1 мл с единым бруцеллёзным антигеном для РА, РСК, и РДСК. Сыворотки крови овец, коз, буйволов, оленей и собак исследуют в разведении 1:25, 1:50, 1:100, 1:200; крупно рогатого скота, лошадей и верблюдов – 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400. РА считают положительным при наличии агглютинации с сыворотками крови крупно рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 МЕ); овец, коз, буйволов, оленей и собак – с 1:50 (50 МЕ) с сыворотками крови крупно рогатого скота, лошадей и верблюдов и 1:25 (25 МЕ) – с сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на два креста.

РСК – Специфичный и высокочувствительный метод диагностики бруцеллёза животных. Её показания более постоянны и сохраняются дольше: комплементсвязывающие антитела появляются позже, чем агглютинины. Эта реакция позволяет выявить большее количество больных в стадах с давней инфекцией. РСК применяют при диагностике бруцеллёза у выше перечисленных видов животных, а также свиней.

РДСК – более чувствительный тест, чем РСК. При инфицированном эпидидимите баранов используют только РДСК с овисным антигеном. РСК и РДСК считают положительными при задержке гемолиза на 2…4 креста в одном или двух разведениях (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена). Сомнительной – при задержке гемолиза с оценкой в один крест.

РПБ – используют для исследования сывороток крови крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей свиней, буйволов, верблюдов и оленей. Реакцию проводят при температуре 18-30 °С с бруцеллёзным антигеном, окрашенным бенгальским розовым, на пластинках с лунками. При положительной реакции в течение 4 мин. Появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

КР – ставят с цельным свежим или консервированным формалином молоком коров и антигеном – взвесью убитых бруцелл, окрашенных в синий цвет гематоксилином. При наличии в молоке специфических антител происходит агрегация антигена, образовавшийся комплекс адсорбируется сливками молока и поднимается с ними вверх, образуя чёткое, окрашенное кольцо. Проводится реакция в уленгутовских пробирках, в которые вносят по 0,05мл антигена, добавляют 1 мл молока и содержимое тщательно смешивают, выдерживают при 37-38 °С в течении 1 часа. Результаты учитывают визуально и оценивают в крестах: +++ - чётко выраженное синее кольцо в верхней части молока, остальная часть молока белая; ++ - достаточно выраженное синее кольцо, столбик молока синеватого цвета. Пробы, давшие реакцию с оценкой три и два креста, считают положительными. Эта реакция показательна для проверки благополучия стад (ферм) по бруцеллёзу крупного рогатого скота и молока на рынках. [9]

Аллергическая диагностика. Основывается явлении инфекционной аллергии к аллергену бруцеллин ВИЭВ. Бруцеллин ВИЭВ, изготовляется из неаглютиногенного и авирулентного штамма B. аbortus B-1. Бруцеллин вводят под кожу нижнего века. У овец, коз и крупно рогатого скота применяют пальцебральную пробу. Овцы и козы по 0,5 мл, КРС по 1 мл, учёт через 48 часов. Свиньям препарат вводят внутрикожно с наружной стороны ушной раковины. У животных, больных бруцеллёзом, на месте введения бруцеллина развивается воспалительная реакция. [9]

Генетическая диагностика. Применяют полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

4. Биопроба. Осуществляют на морских свинках (параллельно с посевами материала на питательные среды), сыворотка которых в разведении 1:5 отрицательно реагирует в РА с бруцеллёзным антигеном. На 15, 25 и 40 – е сутки после заражения берут кровь, из которой получают сыворотку и исследуют её в пробирочной РА в титрах от 1:10 до 1:80. При получении положительных результатов морских свинок убивают (через 60 дней) и из органов (лимфоузлов, селезёнки, печени и костного мозга) делают посевы на питательные среды с целью выделения культуры бруцелл. При выделении культуры возбудителя или получении положительного результата, когда сыворотка реагирует в титре 1:10 и выше лабораторный диагноз бруцеллёза считают установленным. Для выделения культуры морских свинок убивают и делают посевы из лимфоузлов, селезёнки, печени и костного мозга.

Все выделенные культуры бруцелл после их идентификации уничтожают автоклавированием при 1,5 атм. В течение 1 часа. [5]

lV. Иммунитет.

Иммунитет при бруцеллёзе малонапряжённый и непродолжительный, от нескольких месяцев до двух лет. Противобруцеллёзный иммунитет формируется медленно в две фазы: первая фаза – инфекционный, или нестерильный, иммунитет; вторая – постинфекционный, или стерильный, иммунитет. Нестерильный иммунитет обусловлен присутствием возбудителя в организме.

В обезвреживании бруцелл принимают участие гуморальные факторы (опсонины, агглютинины, комплементсвязывающие вещества и не полные антитела). В сыворотке крови больных животных накапливаются в начале IgM , затем IgG , а также неполные (IgA и IgG) антитела. Роль антител в механизме защиты при бруцеллёзе неэффективна: присутствие их в организме не препятствует бактериемии. Но они имеют большое диагностическое значение. В первой фазе отмечается угнетение макрофагальной реакции и фагоциты не способны переваривать бруцелл, что и приводит к диссеминации возбудителя по всему организму. [9]

Иммунитет при бруцеллёзе клеточный (ГЗТ) и обеспечивается Т-системой лимфоцитов. Для бруцеллёза характерно развитие гиперчувствительности замедленного типа (аллергия). Инфекционный иммунитет переходит в постинфекционный постепенно и сопровождается освобождением организма от возбудителя, в результате чего может наступить самовыздоровление. [12]