Гормон роста (соматотропин)

В клинике испытан еще один рекомбинантеый белок, полученный методом микробиологического синтеза - гормон роста человека, который секретируется передней долей гипофиза и содержит 191 аминокислотный остаток. В организме человека этот гормон необходим для роста костей. При внутриутробном развитии он не нужен, однако, его недостаточность резко проявляется в позднем детском возрасте и приводит к карликовости.

Синтез и секреция ГР осуществляются высокоспециализированными клетками гипофиза – соматотрофами. Регулируется секреция ГР гипоталамическими структурами через рилизинг-гормоны, оказывающие стимулирующий (соматолиберин) или подавляющий (соматостатин) эффект. Недавно была открыта новая физиологическая система, контролирующая пульсовую секрецию ГР, – рилизинг-пептиды . Секреция гипоталамических гормонов, в свою очередь, контролируется несколькими нейротрансмиттерными системами (катехоламинэргической, серотонинэргической, дофаминэргической), оказывающими стимулирующий или ингибирующий эффект. На уровне тканей ростовой эффект ГР осуществляется специфическими пептидами – инсулиноподобными факторами роста (ИФР – соматомединами). Основным местом синтеза этих пептидов является печень. Контролирует синтез соматомединов ГР. Основной точкой приложения ИФР являются эпифизы трубчатых костей, где при участии этих пептидов происходит пролиферация хондроцитов и, следовательно, линейный рост ребенка. Секреция ГР подвержена суточным колебаниям и имеет пульсирующий характер. Максимально высокие пики ГР наблюдаются в ночные часы: до 70% суточного количества гормона выделяется ночью. Кроме того, ГР принимает активное участие в адаптационных реакциях организма, поэтому его уровень в течение суток может изменяться и по этой причине. Так, повышение уровня ГР наблюдается при гипогликемии и физической нагрузке. Аминокислоты, глюкагон, вазопрессин, тиреоидные и половые гормоны активно влияют на синтез и выделение ГР и во многом определяют его уровень в крови. Основной эффект ГР – активация анаболических процессов, которые реализуются в ростовом эффекте, увеличение мышечной массы и усиление физической активности. Однако известно, что ГР активно влияет и на другие процессы, которые, безусловно, способствуют реализации ростового эффекта. Так, например, ГР повышает абсорбцию кальция и тем самым улучшает минерализацию костной ткани, активизирует процессы гликогенолиза, липолиза и транспорт глюкозы в ткани и, следовательно, усиливает энергетический обмен. Липолитический эффект ГР также способствует снижению массы тела за счет уменьшения количества подкожного и висцерального жира. Гипохолестеринемический эффект гормона наряду с непосредственным влиянием ГР на сократимость миокарда оказывает существенное влияние на состояние сердечно-сосудистой системы. Хорошо известно влияние ГР на интеллектуальные возможности и психический статус человека: усиливается интеллектуальная активность, улучшаются память и настроение.

Важнейшей клинической проблемой задержек роста у детей является дифференциальная диагностика различных вариантов гипофизарного нанизма с целью определения точного варианта низкорослости, прогноза заболеваний и, следовательно, выбора методов терапии. Долгое время эти больные были абсолютно бесперспективными в плане лечения. Сегодня же дети с дефицитом гормона роста (ГР) на фоне заместительной гормональной терапии рекомбинантным соматотропином прекрасно растут и при длительной терапии могут достичь вполне удовлетворительных параметров физического развития взрослого человека.

Гормон роста клонирован в Escherichia coli.Биологическая активность выделенного белка была идентична образцу, полученному из гипофиза. Следует также отметить, что интенсивно ведутся работы по повышению избирательности действия гормона роста, уменьшению его связывания с рецептором пролактина).

Технология получения соматотропина. Несмотря на большой прогресс, достигнутый в исследовании соматотропных гормонов человека и животных, механизм их действия на молекулярном уровне изучен недостаточно. Отсутствие данных о точной пространственной структуре гормонов этой группы затрудняет исследования их взаимодействия с рецепторами, ограничивает возможности изучения структурно-функциональных взаимоотношений различных участков полипептидной цепи, не позволяет в полной мере использовать достижения белковой инженерии для создания аналогов соматотропинов.

Рекомбинантный соматотропин, получивший название соматрем, стал вторым биосинтетическим фармацевтическим препаратом. СТГ, биологически чистый от вирусных загрязнений, впервые был получен в 1980 году фирмой “Genetech”. Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, отличается от гормона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на NH₂ конце молекулы.

Весь технологический цикл состоит из пяти функционально различных этапов:

1 ферментация

2 первичная очистка белка

3 хроматографическая очистка

4 изготовление лекарственной формы

5 анализ качества субстанции и лекарственной формы соматогена

На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от первой до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем подстроили к паре промоторов (промотор – специфическая последовательность в ДНК, необходимая для инициации транскрипции РНК-полимеразы) и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составляет 2,4 млг на мл культуры Е. соli ( 100000 молекул гормона на клетку). СТГ, синтезированный в бактериях, обладал нужной молекулярной массой и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было отщеплять.

Изменяя аминокислотную последовательность СТГ посредством модификации кодирующего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы и этиологии карликовости на молекулярном уровне.

Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста и факторы дифференцировки тканей, выделив их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А, стимулирующему фиксацию серы в хряще, образование которого индуцируется соматотропином.

В 1982 году выделен и синтезирован полипептид, содержащий 44 аминокислотных остатка, обладающий полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропниа. Применение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипофизарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.

Важной особенностью технологического цикла промышленного производства является обеспечение апирогенности при проведении хроматографической очистки белка.

Неоътемлемой составной частью каждого технологического цикла промышленного производства является проведение сложного комплекса анализов качества продукта. В основе объема и номенклатуры этих анализов лежат соответствующие рекомендации ВОЗ.

Рекомбинантные белковые факторы врожденного иммунитета.

К числу используемых в качестве лекарственных средств видоспецифичных белков относятся интерфероны - факторы врожденного иммунитета. Это группа белковых веществ, вырабатываемых зараженными вирусами. Они индуцируют локальные и системные противовирусные реакции в других клетках, и, соответственно. Используются как противовирусные препараты.

Виды интерферонов:

1.L-группа (лейкоцитарный интерферон)

2.В-группа (интерфероны фибробластов)

3.G-группа (иммунный интерферон Т-лимфоциты)

До недавнего времени интерфероны из человеческих клеток были доступны лишь в малых количествах. Как медицинский препарат использовался лейкоцитарный интерферон. Его источником служила кровь , получаемая из родильных домов. В настоящее время ген лейкоцитарного интерферона получен путем химического синтеза. Затем он был включен в плазмиды, которые в свою, очередь, были введены в клетки кишечной палочки и клетки дрожжей, ставшие таким образом продуцентами лейкоцитарного интерферона человека.

Далее следует отметить, что ген интерферона из фибробластов человека был клонирован в клетках кишечной палочки. Также ведется работа по созданию методами генетической инженерии гибридных интерферонов с большей противораковой активностью, чем у природных. Это относится к получению гибридов между интерферонами альфа 1 и альфа 2.

Вообще возможность получения и использования в медицине иммуномодифицированных рекомбинантных белков привлекает все большее внимание. Можно отметить, в частности, цикл исследований, посвященных основному или главному катионному белку нейтрофилов, который обладает одновременно бактерицидной активностью и способностью нейтрализовать эндотоксин грамотрицательных бактерий. Это обусловлено повышением проницаемости внешней мембраны последних ( отсюда, шифр белка – bactericidal, permeability increasing). Этот белок имеет молекулярную массу 55kD и обладает исключительно высоким сродством к липиду А внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Использование его как химиотерапевтического препарата, вводимого извне «в помощь» нейтрофилам своего организма, является весьма перспективным. Рационально использовать ВPI человеческого происхождения во избежание аллергических реакций, но в данном случае, естественно, возникает проблема дефицита сырья. Необходимо отметить что, являясь ингибитором воспалительных реакций, на уровне эндотоксина данный белок конкурирует с одним из белков острой фазы(образуемых печенью), который стимулирует противовоспалительные реакции. В настоящее время ВPI получен генноинженерными методами, причем его молекулярная масса значительно меньше, чем в лекарственной форме, так как в этом случае используется лишь N- терминальная часть рекомбинантного белка с молекулярной массой 21kD.