3.2. Механизмы инактивации тромбина и других протеиназ гемостаза.
3.2.1. Инактивация протеиназ серпинами.
Ингибиторы сериновых протеиназ называют серпинами. К серпинам относятся: антитромбин III (АТIII, син. АТ), α1-ингибитор протеиназ (α1-ИП, син. α1-антитрипсин), кофактор II гепарина (HIIC) и ингибитор ФXa, зависимый от протеина Z, (ZPI) (табл. 2-4).
Серпины происходят от общего предшественника. Их функции дивергировали в эволюции, которая происходила параллельно эволюции сериновых протеиназ. Эти протеиназы прошли путь от трипсиноподобных протеиназ широкого спектра протеолиза до высокоспецифичных, регуляторных протеиназ, узкого спектра действия, способных быстро и точно реагировать на нарушение гемостаза.
3.2.1.1. Инактивация тромбина антитромбином III
Несмотря на высокую степень гомологии аминокислотной последовательности АТIII и α1-ИП, их специфичность различна. Это обусловлено существованием в реактивном участке АТIII пептидной связи Арг393-Сер394, расщепляемой преимущественно тромбином и фактором Xa, тогда как в реактивном участке α1-ИП находится связь Мет358-Сер359, гидролизуемая эластазой нейтрофилов. Замена реактивного метионина в положении Р1 расщепляемой связи (по номенклатуре Шехтера и Бергера) на аргинин в мутантной молекуле α1-ИП Питтсбург (названной по имени города, в котором обнаружен больной с этим дефектом) привела к изменению специфичности от протеазы химотрипсинового типа, как эластаза, к трипсиноподобным протеазам, таким как тромбин. Результатом гетерозиготного повреждения молекулы α1-ИП была смерть мальчика в очень молодом возрасте вследствие массивных и продолжительных кровотечений, поскольку дефектный ингибитор (α1-ИП), содержащийся в плазме в высокой концентрации (1,3г/л), имел свойства АТIII (0,15 г/л), и блокировал даже низкие концентрации свертывающего фибриноген фермента тромбина.
АТIII ингибирует протеиназы системы свертывания крови (преимущественно тромбин, фактор Xa, а также IXa) путем образования эквимолярного комплекса. Механизм инактивации АТIII подобен мышеловке (suicidesubstrate механизм), где ловушка (серпин АТIII) привлекает мышей (протеазы) куском сыра (реактивная петля ингибитора RCL).
Изучение кристаллографических структур комплексов серпин-протеиназа позволило представить последовательность событий, ведущих к инактивации протеиназы (рис. 3-30).
Рис. 3- 30
Этапы инактивации тромбина антитромбином III на основании исследования кристаллографических структур комплексов серпин-протеиназа.
1.Узнавание активным центром тромбина и связывание петли реактивного центра (RCL) серпина АТIII. 2.Расщепление петли серпина по связи Арг393-Сер394, включение петли RCL в середину складчатой структуры молекулы АТIII и конформационные изменения серпина в стабильное состояние. 3. Передвижение молекулы тромбина, привязанной к петле RCL, вдоль молекулы АТIII к противоположному концу ингибитора, потеря упорядоченной структуры и активности.
Первый этап – узнавание ингибитора активным центром протеиназы, а затем и связывание петли реактивного центра (RCL) серпина (АТIII). На следующем этапе происходит расщепление петли ингибитора протеиназой, быстрое включение петли RCL в середину складчатой структуры молекулы АТIII (β-sheet) и конформационные изменения серпина в более стабильное состояние. Далее протеиназа, привязанная к петле реактивного центра серпина, передвигается к противоположному концу молекулы ингибитора, теряет упорядоченную структуру и активность. Таким образом, конформационные сдвиги в молекуле серпина напоминают работу мышеловки, которая физически захлопывает протеиназу. Изменение от стрессированной (метастабильной) формы серпина в релаксированное состояние сопровождается переходом в гиперстабильную форму молекулы, неактивную, латентную форму. При этом происходит необратимое ингибирование протеиназы.
Реакция инактивации протеазы АТIII происходит медленно, но прогрессивно ускоряется гликозаминогликанами (ГАГ) эндотелия и гепарином. Поэтому АТIII носит название прогрессивного ингибитора.
Гепарин – гликозаминогликан (ГАГ) с мол. массой 5-20кДа, синтезируется в тучных клетках, часто локализованных вдоль сосудов, как сополимер гексозамина и глюкуроновой кислоты. На последней стадии синтеза остатки глюкозамина деацетилируются и N-сульфатируются, а остатки глюкуроновой кислоты эпимеризуются в стериоизомер – идуроновую кислоту, имеющую ассимметричный атом углерода. Кроме того, идуроновая кислота сульфатируется.
При активации тучных клеток гепарин освобождается из гранул клеток и может участвовать в регуляции гемостаза.
Гепарин катализирует инактивацию протеиназ, повышая скорость реакции более чем в 1000 раз. Драматическое повышение скорости ингибирования тромбина АТIII в присутствии каталитических количеств гепарина обусловлено связыванием этого полианиона с определенными остатками лизина (Лиз 114, Лиз125, Лиз287), а также Арг 47, Про41, Трп49 N(амино)-конца АТIII, формирующего гепаринсвязывающий домен (рис. 3-31).
Рис. 3-31
Схема инактивации тромбина антитромбином III (АТIII) в комплексе с гепарином(H) – катализатором процесса.
Молекулярной основой высокого сродства гепарина к АТIII служит уникальный пентасахарид с 3-О-сульфатированным гликозамином в третьем остатке, который вызывает конформационную перестройку молекулы ингибитора, изменение в положении реактивного аргинина АТIII, благоприятствующее взаимодействию с тромбином и фактором Xa (рис. 3-32). Около 1/3 молекул гепарина содержат эту структуру и с высоким сродством связывают АТIII.
Рис. 3- 32
Уникальный пентасахарид гепарина с 3-О-сульфатированным гликозамином в третьем остатке.
Изолированный пентасахарид малоэффективен в катализе ингибирования свертывания. Для связывания АТIII и протеиназы требуется фрагмент гепарина из 18 моносахаридов. Это так называемый низкомолекулярный гепарин (НМГ), который ингибирует преимущественно фактор Xa свертывания крови и тем самым останавливает процесс образования тромбина. При этом, чем короче цепочки молекулы гепарина, тем меньше ее способность образовывать комплексы с серпином, инактивирующие тромбин, и выше способность к избирательному блокированию активности только фактора Xa. Поэтому гепарины с низкой молекулярной массой (НМГ) ингибируют преимущественно фактор Xа, не вызывая при этом существенной нейтрализации тромбина. Один из них – Надропарин кальция (Фраксипарин) ( Мол. вес 4,3 кДа), у которого соотношение анти-Xa и антитромбиновой активности составляет 3,3:1, в то время как у гепарина – 1:1. Это позволяет добиться избирательного торможения свертывания на более ранней стадии процесса. Надропарин кальция получают с помощью контролируемой деполимеризации гепарина натрия из слизистой оболочки тонкой кишки свиней и последующей хроматографической очистки. Надропарин кальция состоит из сульфатированных олигосахаридов, содержащих остатки 2,5-ангидро-D-маннитола в качестве концевых групп.
Нефракционированный гепарин (НФГ) долгое время оставался золотым стандартом среди лекарственных средств с доказанной эффективностью в предупреждении и лечении как венозных, так и артериальных тромбозов и эмболий, в частности, при лечении острого коронарного синдрома.
Однако целый ряд ограничений и побочных эффектов, свойственных этому препарату, и, в первую очередь, короткий период полувыведения и необходимость постоянной внутривенной инфузии с лабораторным контролем, низкая биодоступность, относительно высокая частота геморрагических осложнений, зависимость эффекта от уровня АТIII плазмы, синдром "рикошета" при отмене, аллергенность и вызываемая им тромбоцитопения способствовали появлению нового класса антикоагулянтов с меньшей молекулярной массой.
Применение НМГ имеет ряд преимуществ перед НФГ: высокая антитромботическая активность при меньшем риске развития кровотечений; высокая биодоступность и предсказуемость действия; отсутствие необходимости частого лабораторного контроля; относительно пролонгированное действие; менее выраженное влияние на функцию тромбоцитов и повышение высвобождения ингибитора пути тканевого фактора (TFPI) эндотелием сосудов.
В настоящее время НМГ применяют при лечении тромбоза глубоких вен, тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА), острого коронарного синдрома, нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда и для профилактики тромбообразования у больных при операциях, а также для профилактики тромбоза в системе экстракорпорального кровообращения при гемодиализе и гемофильтрации.
Итак, при связывании АТIII с гепарином изменяется конформация молекулы АТ, повышается сродство к протеиназам. Существование в структуре АТIII двух участков связывания: реактивного, ответственного за связывание фермента, и домена, связывающего гепарин, подтверждено анализом заболеваний, вызванных врожденными дефектами молекулы АТIII. Замена Арг393 реактивного участка АТ III на Цис в АТ Норсвик Парк или на Гис в АТ Глазго приводила к блокированию способности ингибитора взаимодействовать с тромбином, что проявлялось в семейных тромбозах. Нарушения структуры домена, связывающего гепарин, вследствие замены Арг47 на Цис в АТ Тойома или на Гис в АТ Руан-1 также приводили к рецидивирующим тромбозам. Кроме того, с серьезными эпизодами тромбоза связаны конформационная нестабильность (аномалии) в молекуле АТIII, когда реактивная петля ингибитора в интактной (нерасщепленной форме) включается в складчатую структуру молекулы (как это происходит при физиологической реакции включения расщепленной петли при связывании антитромбина с протеиназой). Конформационная стабильность АТ возрастает при образовании комплекса с низкомолекулярным гепарином (НМГ), что делает НМГ антикоагулянтом первого выбора при лечении «конформационных» тромбозов.