2.3.2.2. Образование сериновых протеаз гемостаза.
Фактор VII- зависимый от витамина К, одноцепочечный, гликозилированный мультидоменный белок (406 а.о.), содержит N-концевой -карбоксиглутаминовый домен (Гла-домен), содержащий 10 остатков -карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), и каталитический (протеазный) домен, гомологичный трипсину и химотрипсину по аминокислотной последовательности. Доменная структура молекулы белка и организация гена фактора VII подобны таковым других витамин К зависимых факторов – IX, X , протеина С и протеина S ( рис. 2-13).
Рентгеноструктурным анализом кристаллической структуры комплекса растворимой формы тканевого фактора (лишенной трансмембранного и цитоплазматического домена) и ингибированного
по активному центру фактора VIIa показано, что фермент, связанный с мембраной через Гла-домен, имеет протяженные контакты с тканевым фактором. Тканевой фактор подобен стержню, включенному в фосфолипидные везикулы мембраны, вокруг которого “закручивается” молекула фактора VIIa. Основные участки контакта фактора VIIa с тканевым фактором локализованы в первом EGF домене и каталитическом домене, а дополнительные точки контакта – в гидрофобном стеке, Гла-домене и втором EGF домене. Благодаря такому контакту комплекс ТФ/VIIa ориентирован перпендикулярно поверхности мембраны(рис. 2-21).
РИС. 2-21
Модель структуры комплекса тканевого фактора с фактором VIIa( ТФ/VIIa)
Тканевой фактор состоит из трех доменов: N-концевого внеклеточного домена , гидрофобного трансмембранного участка и С-концевого внутриклеточного “хвоста” . Внеклеточная часть молекулы тканевого фактора состоит из двух доменов ( F1 и F2), подобных доменам фибронектина( FN-1 и FN-2). Фактор VIIa состоит из N-концевого Гла-домена( G), двух доменов, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены Е1 и Е2), и С- концевого каталитического (протеазного) домена(VIIa)
Тканевой фактор изменяет локализацию и ориентацию активного центра фактора VIIa относительно мембраны: расстояние от активного центра фермента до мембраны уменьшается, что способствует эффективному расщеплению пептидных связей субстратов ( факторов X и IX ), также связанных с мембраной через Гла-домены.
Взаимодействие фактора VII с тканевым фактором является зависимым от ионов кальция (Са2+). Девять участков молекулы фактора VII участвуют в связывании Са2+ : семь сайтов в Гла-домене, один – в EGF I домене и еще один в каталитическом домене. Для высокоаффинного связывания фактора VII с тканевым фактором очень важно низкоаффинное ( Kd < 1mM) связывание Са2+ с Гла-доменом.
Комплекс ТФ/VIIa связывает фактор X и превращает его в фактор Xа.
В отличие от других зависимых от витамина К факторов протромбинового комплекса фактор X состоит их двух цепей, соединеных дисульфидной связью. Легкая цепь (139ао) содержит в структуре N-концевой Гла-домен с 11 остатками -карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), в первом их которых локализован β-гидроксилированный Asn63 . Тяжелая цепь(306 ао), содержащая все углеводы фактора X , содержит на N-конце гликозилированный пептид активации ( 52ао) и каталитический (протеазный) домен.
ТФ/VIIa образуя тройной комплекс с фактором X (ТФ/VIIa/X) расщепляет его со скоростью в 2х107 раз большей, чем свободный фактор VIIa . Комплекс ТФ/VIIa отщепляет N- концевой пептид активации , гидролизуя одну связь Arg194-Ile195 в тяжелой цепи , что приводит к образованию каталитически активного фактора Xа ( триада активного центра - His236,Asp282 и Ser379) . Молекула фактора Xа остается ассоциированной с комплексом через N- концевой Гла –домен легкой цепи .
Моделирование структуры комплекса TФ/VIIa/Xa с помощью докинга (анализа комплементарности третичных структур) и сайт-направленного мутагенеза, показало, что фактор Xа имеет протяженную конформацию, подобную структуре фактора VIIa в комплексе TФ/VIIa . Во взаимодействии с TФ/VIIa участвуют все домены фактора Xа, в том числе аминокислотные остатки Glu51 и Asn57 первого домена EGF, Asp92 и Asp95 второго EGF домена и Asp185a, Lys186, и Lys134 каталитического домена фактора Xа.
N-конец каталитического домена ориентирован таким образом, что может осуществляться как активация фактором Xа фактора VII, связанного с тканевым фактором, так и активация фактором VIIa профермента - фактора X .
Следует подчеркнуть, что комплекс ТФ/VIIa имеет чрезвычайно узкую субстратную специфичность, активируя ограниченным протеолизом только факторы X и IX.
Вначале образуется небольшое количество (пкМ) фактора Xa, который не только активирует фактор VII, связанный с тканевым фактором, но также стимулирует появление следовых (нМ) концентраций тромбина, достаточных для активации кофакторов - факторов V и VIII - в активные формы (факторы Va и VIIIa), а так же для активации рецептора PAR1 тромбоцитов, эндотелия и активации антикоагулянтной системы протеина С благодаря связыванию с рецептором- тромбомодулином эндотелия. Эта медленная фаза инициации свертывания (рис. 2-20,2-22).
РИС 2-22
Схема фазы инициации свертывания крови
Тромбин в низкой (нМ) концентрации связывает тромбомодулин эндотелия (ТМ) и запускает активацию системы протеина С, превращая протеин С (РС), связанный с рецептором EPCR в протеиназу - АРС., которая инактивирует кофакторы Va и VIIIa, и регулирует воспаление и выживаемость клеток, взаимодействуя с рецепторами EPCR и PAR1. Тромбин (нМ) активирует PAR1 тромбоцитов, но для активации PAR4 необходимы более высокие (>нМ) концентрации тромбина. Тромбин активирует факторы V и VIII в активные формы Va и VIIIa(кофакторы факторов Xa и IXa) , необходимые для активации фазы распространения свертывания крови.
Вслед за стадией инициации следует быстрая фаза распространения свертывания. Комплекс фактор TФ/VIIa активирует фактор IX в протеиназу – фактор IXа( рис.2-20,2-23).
РИС.2-23