2.4. Функции протеиназ системы свертывания крови
2.4.1. Тромбин: структурно-функциональные особенности.
Тромбин-протеолитический фермент, относится, как и все ферменты свертывающей системы крови (кроме фактора XIIIa), к группе пептид-гидролаз, подгруппе протеиназ, классу сериновых протеиназ семейства трипсина.
Тромбин – гликопротеид( 37 kDa), содержащий около 5% углеводов. Молекула тромбина состоит из двух полипептидных цепей ( А и Б), соединенных дисульфидной связью (рис. 2- 25).
РИС.2-25
Структура молекулы тромбина.
Тромбин cвязан в активном центре с ингибитором PPACK (D-Phe-Pro-Arg- хлорметилкетоном ) и ионом Na.
Молекула тромбина состоит из двух полипептидных цепей (А и Б), соединенных дисульфидной связью. В структуре молекулы тромбина кроме активного центра, в который входит триада каталитического участка активного центра – Гис 57, Асп 102 и Сер 195, отмеченные *, и участки первичного и вторичного связывания ( в том числе D189 первичного связывающего участка, локализованного на дне каталитического кармана) обнаружены экзосайты, экспонированные на поверхности молекулы: анионсвязывающий экзосайт 1 (АВЕ1), экзосайт 2 (АВЕ 2), и сайт связывания ионов Nа . Экзосайты локализованы вне активного центра молекулы.
А-цепь тромбина быка содержит 49 ао, а у тромбина человека она укорочена на 13 ао с N-конца молекулы. Б-цепи обоих тромбинов почти идентичны и состоят из 259 остатков. Структура Б-цепи тромбина поддерживется тремя дисульфидными связями. Выявлена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности тромбина и родственных протиназ – трипсина и химотрипсина в тех частях молекулы, где локализованы аминокислоты триады каталитического участка активного центра – Гис 57, Асп 102 и Сер 195, образующие систему переноса заряда. Активность тромбина, как и других сериновых протеиназ, подавляется диизопропилфторфосфатом (ДФФ) и тозиллизилхлорметилкетоном, избирательно блокирующими, соответственно, серин и гистидин активного центра.
Тромбин и трипсин имеют одинаковую первичную специфичность: они расщепляют эфирные,амидные и пептидные связи основных аминокислот– аргинина и лизина. Но тромбину, в отличие от трипсина, свойственна избирательность при отборе субстратов и расщепляемых связей. Он не гидролизует обычные субстраты протеиназ такие, как казеин, гемоглобин, альбумин, а проявляет специфичность высшего порядка в выборе субстратов и гидролизуемых связей.
В отличие от трипсина тромбин-узкоспецифичная протеиназа, тк расщепляет только одну или несколько связей в своих специфических субстратах ( факторах V и VIII, фибриногене и др) и рецепторах, активируемых протеиназами ( PAR-1и PAR-4).
Высокая специфичность тромбина в отношении определенных субстратов и рецепторов клеток обеспечивается определенными участками в структуре тромбина, так называемыми экзосайтами, экспонированными на поверхности молекулы: анионсвязывающим экзосайтом 1(АВЕ1) ( называемым также центром узнавания субстратов и рецепторов) и экзосайтом 2 (рис. 2-25). Экзосайты локализованы вне активного центра на поверхности молекулы. Анионсвязывающий экзосайт 1 отвечает за взаимодействие тромбина с комплементарными участками рецепторов клеток (тромбомодулином эндотелия, PAR,) и специфических субстратов (фибриногена, факторов VIII,V, кофактора II гепарина). Анионсвязывающий экзосайт 2 обеспечивает связывание тромбина с гепарином, ГПIba тромбоцитов. В области анионсвязывающего экзосайта 1 происходит взаимодействие тромбина с его высокоспецифическим экзогенным ингибитором - гирудином. Гирудин (7kDa)– полипептид из секрета слюнных желез медицинской пиявки (Hirudo medicinalis), который в пикомолярной концентрации блокирует протеолитическую активность фермента с константой ингибирования Ki равной 10-13 .
Для расщепления тромбином менее специфических субстратов , таких как протеин С, TAFI (ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином), факторы свертывания крови XI и XIII ( фибринстабилизирующий фактор) необходимо предварительное связывание тромбина через экзосайты молекулы с кофакторами, каковыми могут быть специфические рецепторы или субстраты. Предварительное специфическое взаимодействие тромбина с кофакторами вызывает аллостерические конформационные изменения молекулы фермента, облегчающее разщепление не специфических субстратов тромбина.
Так, для эффективной реакции активации тромбином протеина С и TAFI необходимо связывание фермента через его АВЕ1 с рецептором на эндотелии тромбомодудином (ТМ). Для активации тромбином фактора XI свертывания крови необходимо предварительное взаимодействие АВЕ2 молекулы фермента с рецептором тромбоцитов ГП Iba. Для эффективной активации фактора XIII тромбин должен сначала связаться через его АВЕ1 с фибриногеном, чтобы затем расщепить определенные пептидные связи в молекуле фактора XIII.
C помощью рентгеноструктурного анализа и сайт-направленного мутагенеза выявлены конформационные изменения, происходящие в молекуле тромбина при связывании иона Na, которые приводят к повышению скорости расщепления фибриногена и других прокоагулянтных специфических субстратов и рецепторов ( рис 25,26).
Рис 2-26.