1.4.2. 2. Механизмы агрегации тромбоцитов
Активация тромбоцитов ведет к клеточным ответам, формально различным, но на самом деле неразрывно связанным друг с другом:
1) морфологическим: структурным изменениям, ведущим к формированию тромбоцитарной пробки;
2) биохимическим: освобождению и синтезу специфических компонентов.
Под действием индукторов активированные тромбоциты изменяют форму от дисковидной до сферической; образуют псевдоподии, объединяются в рыхлые агрегаты. Затем следует секреция содержимого гранул во внешнюю среду через систему открытых каналов. При действии тромбина на тромбоциты уже через 5 секунд после стимуляции происходит изменение формы клетки, централизация гранул, секреция их содержимого в систему открытых каналов и далее во внеклеточную среду. Сложная система сократительных белков участвует в сохранении формы клетки, главные из которых – актин, миозин, тропонин, актин-связывающий белок, система микротрубочек. Все эти белки участвуют в реализации действия индуктора.
1.4.2.3. Активация тромбоцитов коллагеном
Действие агонистов на тромбоциты осуществляется через специфичесие рецепторы (табл. 1-1). Коллаген субэндотелия служит эффективным субстратом связывания тромбоцитов к поврежденному участку сосуда и активатором клеток, поддерживая их стабильную адгезию, активацию и рост тромба через два основных рецептора – ГП VI и интегрин a2b1 (ГП IaIIa) (рис. 1-5).
ГП VI – член Ig суперсемейства. Связывание коллагена с ГП VI тромбоцитов ведет к кластеризации и последующему фосфорилированию (по ITAM доменам) FcR g-цепей (ассоциированных с рецептором) Srk киназами (Fyn и Lyn). Последние вызывают активацию Syk киназы, которая, в свою очередь, фосфорилирует адапторные белки LAT и SLP-76. В конце концов, сигнальный каскад ведет к фосфорилированию и активации PLCg2, повышению концентрации внутриклеточного кальция, активации PKC, освобождению AДФ и стимулированию эффективной активации тромбоцитов.
Активация коллагеном рецептора ГП VI может “сдвигать” интегрины a2b1 и aIIb/b3 из низкоаффинного в высокоаффинное состояние, приводя к активации тромбоцитов и стабильному прикреплению клеток к поврежденной стенке сосуда.
Адгезия тромбоцитов к коллагену через интегрин a2b1 также стимулирует внутриклеточную сигнализацию, которая ведет к активации Srk киназ, PLCg2 , повышению концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i). Эта реакция приводит к стабилизации адгезии, распластыванию тромбоцитов, их активации и экспозиции на поверхность тромбоцита интегрина aIIb/b3. Интегрин aIIb/b3 через мостики фибриногена рекрутирует еще не адгезированные тромбоциты.
За адгезией и активацией тромбоцитов адгезивными белками следует стадия агрегации активированных тромбоцитов, стимулируемая освобождаемыми клетками или вновь синтезированными индукторами агрегации, и создание активной поверхности для осуществления механизмов свертывания крови.
1.4.2.4. Активация тромбоцитов тромбином
Тромбин – трипсиноподобная сериновая протеиназа (КФ 3.4.21.5), превращает фибриноген крови в фибрин (см. главу 2). В очень низких наномолярных концентрациях (которые на несколько порядков ниже тех, что необходимы для расщепления фибриногена) тромбин активирует тромбоциты через специфические рецепторы, называемые «рецепторами, активируемыми протеазами» (РАR). Взаимодействие тромбина с подтипом 1 рецепторов – РАR1, стимулирует агрегацию тромбоцитов, вызывает мультимеризацию ГПIba рецепторов, что повышает эффективность расщепления PAR1. ГП Iba служит кофактором PAR1.В высоких концентрациях тромбин активирует PAR4 на тромбоцитах,что приводит к усилению ответа клеток( см.главу 2).
Рецепторы тромбина PAR1 и PAR4 относится к суперсемейству семидоменных трансмембранных рецепторов, сопряженных с разными подтипами ГТФ-связанных G-белков. В отличие от других членов суперсемейства рецепторов ,связанных с G-белками рецепторы тромбина расщепляется ферментом по амино (N)-концу молекулы. Возникающий в результате гидролиза рецептора новый аминоконцевой пептид, так называемый “привязанный лиганд”, служит агонистом этого рецептора (см главу 2). Следующие основные биохимические реакции включаются в активацию тромбоцитов тромбином (рис. 1‑10).
Рис 1-10
Схема активации тромбоцитов тромбином.
Взаимодействие тромбина с рецепторами PAR-1/4 на мембране тромбоцита стимулирует передачу сигнала внутрь клетки и ее активацию через семейство регуляторных, связывающих гуаниннуклеотиды G-белков – гетеротримеров, состоящих из α-субъединицы и βγ-субъединиц. Активация PARs и взаимодействие с α-субъединицей, приводит к обмену связанного GDP на GTP, диссоциации гетеротримера и взаимодействию α-субъединицы (либо βγ) с белком-мишенью. PAR-1/4 взаимодействуют с α-субъединицами G12/13-, Gq- и Gi-белков. Связывание PARs с G12/13 ведет к активации малого G-белка Rho и отвечает за изменение формы тромбоцитов, образование псевдоподий. Сигналы, опосредованные белком Gq ведут к активации фосфолипазы Сβ, запуску гидролиза фосфоинозитидов мембраны до двух вторичных посредников: водорастворимого инозитол-1,3,4-трифосфата (ИФ3), вымывающегося в цитозоль, и липофильного 1,2-диацилглицерина (ДАГ), который остается в мембране. ИФ3 вызывает освобождение ионов кальция из плотной тубулярной системы и плазматической мембраны в цитозоль. ДАГ активирует протеинкиназу С, которая фосфорилирует белки. Более того, сигналы, индуцируемые тромбином при активации PAR-1/4, ведут к фосфорилированию протеинкиназ, активируемых митогеном (MAPK), активации рецепторных тирозинкиназ и других белков, образованию протеинкиназ. Эти процессы отвечают за множество реакций клеток, включая секрецию гранул, активацию интегринов, агрегацию тромбоцитов, прокоагулянтную и провоспалительную активности тромбоцитов. Активированные тромбином тромбоциты секретируют содержимое гранул, синтезируют и освобождают агонисты агрегации, в том числе тромбоксан А2.. Вследствие активации Са-зависимых протеаз происходит кластеризация рецепторов адгезивных белков, интегринов aIIb/b3 в псевдоподиях, изменение их конформации и экспонирование на поверхности. Повышается текучесть мембраны, происходит перераспределение фосфолипидов таким образом, что на поверхности мембраны оказываются тромбогенные. Нарушается связь рецепторов с мембраной, происходит нарушение мембранного скелета, распластывание. Перестройка мембраны превращает ее в активный матрикс для связывания факторов свертывания крови, образования комплексов кофакторов и проферментов и их активации. На поверхность тромбоцитов мобилизуются Р-селектин и CD40лиганд, обеспечивающие стабилизацию агрегатов и их связывание с лейкоцитами и активированным эндотелием, а также тканевой фактор, образуемый альтернативным сплайсингом, который провоцирует свертывание крови и тромбообразование .