26. Способы определения тромбоцитов, сравн. Хар-ка.

Подсчет количества

В практике при подсчете тромбоцитов используют методы, основанные на двух принципах: 1) непосредственный подсчет в крови (с помощью счетной камеры или счетчика) и 2) подсчет в мазках крови на определенное количество эритроцитов с пересчетом на 1 мкл или 1 л с учетом общего количества эритроцитов в крови. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки. Существенным преимуществом первой группы методов является их большая точность. Непосредственный подсчет тромбоцитов в крови удобен еще и потому, что не требует для расчета сведений о количестве эритроцитов, но подсчет в камере более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостатком этих методов является необходимость подсчета тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови. Подсчет тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности методам непосредственного подсчета в камере или с помощью счетчиков и автоматов. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены несколькими причинами: плохое качество мазка и связанное с этим неравномерное распределение тромбоцитов, неточный подсчет эритроцитов в крови. Существенное неудобство метода — необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его — возможность подсчета тромбоцитов в любое время независимо от момента взятия крови. В качестве унифицированных утверждены два метода, основанных на обоих принципах.

Унифицированный метод подсчета в камере.

П р и н ц и п . Подсчет тромбоцитов в 1 мкл (или 1 л) с учетом разведения крови и объема квадрата счетной сетки с применением фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.

Р е а к т и в ы . Применяют реактив 1 или 2. 1. Кокаина гидрохлорид — 3 г, натрия хлорид — 0,25 г, фурацилин — 0,025 г, дистиллированная вода — 100 мл. 2. 1 % раствор оксалата аммония. Раствор кипятят и фильтруют.

Хранят в холодильнике. Сравнительный анализ разных разводящих жидкостей позволил считать лучшим 1 % раствор оксалата аммония, так как он дает быстрый и полный лизис эритроцитов.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . I. Микроскоп. 2. Фазово-контрастное устройство. 3. Счетная камера Горяева. 4. Осветитель к микроскопу (ОИ-7, ОИ- 18).

Ход о п р е д е л е н и я . Разводят исследуемую кровь в 200 раз; для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива 1 или 2 и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25 — 30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру (см. подсчет лейкоцитов). Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру; подносят каплю ее с помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в бороздки.

Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Производят подсчет тромбоцитов в 25 больших квадратах.

Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет образований.Расчет числа тромбоцитов проводят, исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (25) и объема одного большого квадрата (1/250 мкл, т.к. сторона квадрата 1/5 мм, высота 1/10 мм)

Х = (а*250*200)/25 = а*2000

X — число тромбоцитов в 1 мкл крови; а — число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах.

Практически число сосчитанных тромбоцитов умножают на 2000.

Унифицированный метод подсчета в мазках крови (по Фонио).

П р и н ц и п . Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Р е а к т и в ы . Применяют реактив 1 или 2. 14 % раствор сульфата магния. 2. 6 % раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Не требуется.

Х о д о п р е д е л е н и я . Смешивают кровь с реактивом 1 или 2, для этого взятый капилляром Панченкова реактив до метки 75 вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки 0. Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому — Гимзе в течение 2—3 ч (при использовании реактива 1) и в течение 30—5 мин (при использовании реактива 2).

Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно). Тромбоциты в мазках выглядят в виде фиолетовых округлых образований размером 2—4 мкм с отчетливо видимой центрально расположенной зернистой частью — грануломером и более светлой периферической незернистой зоной — гиаломером.

Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Для удобства счета и большей точности следует пользоваться специальным окуляром с уменьшенным полем зрения; при отсутствии окуляра можно уменьшить поле зрения простым приемом.

Р а с ч е т : количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А°/оо. Зная число эритроцитов в 1 мкл (в 1 л) крови, легко подсчитать количество тромбоцитов в 1 мкл крови (в 1 л).

Например. А = 60%о; число эритроцитов 5000000 в 1 мкл (5 •10⁶/мкл или 5 •10¹²/л).

Составляют пропорцию: 60—1000; X —5 000 000, откуда

X = 300 •1000 мкл (300 •103/мкл или 300 •109/л).

Подсчет в автоматическом счетчике.

Использование счетчиков и автоматов существенно облегчает подсчет тромбоцитов в крови, повышает точность и ускоряет процедуру подсчета.

Тромбоциты (кровяные пластинки, PLT, platelets) - форменные элементы крови, участвующие в гемостазе. Тромбоциты - мелкие безъядерные клетки, овальной или круглой формы; их диаметр 2-4 мкм.

Референтные значения для мануального метода: 180 – 320 х 109/л.

Референтные значения для автоматического метода зависят от типа анализатора.

Гемостатический минимум тромбоцитов в крови 50 х 10⁹/л.

Тромбоцитарные индексы:

Средний объем тромбоцитов (MPV-mean platelet volume) выражается в фемтолитрах (фл) или в кубических микронах (мкм3). В норме этот показатель варьирует от 7,4 до 10,4 фл.

Распределение тромбоцитов по объему (PDW- platelet distribution width) – измеряется в процентах (коэффициент вариации тромбоцитометрической кривой) и количественно отражает гетерогенность популяции этих клеток по размерам (степень анизоцитоза тромбоцитов).

В норме этот показатель составляет 10—20%.

Тромбокрит (PCT- platelet crit) является параметром, который отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами. Он аналогичен гематокриту и выражается в процентах.

В норме тромбокрит составляет 0,15-0,40%.

Принцип работы большинства счетчиков основан на кондукторометрическом методе.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Счетчик для тромбоцитов.

Ход и с с л е д о в а н и я соответствует инструкции, приложенной к прибору.

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Снижение количества тромбоцитов в крови —тромбоцитопения —является важным симптомом при некоторых формах геморрагического диатеза.

Наиболее выраженная тромбоцитопения (50 XX 103/мкл и ниже) наблюдается при обострении тромбоцитопенической пурпуры. Тромбоцитопения обычно сопутствует острым лейкозам в развернутой стадии и особенно терминальной стадии хронических лейкозов. Умеренная тромбоцитопения (100 •103/мкл и более) наблюдается при коллагенозах, циррозах печени. Повышение количества тромбоцитов в крови — тромбоцитоз — характерно для миелопролиферативных заболеваний, наблюдается при злокачественных новообразованиях. Высокий тромбоцитоз (1000 •10³/мкл и более) может быть у больных после спленэктомии.

Изменение количества тромбоцитов

Тромбоцитоз - увеличение количества тромбоцитов более 320 х 109/л. Различают реактивные и опухолевые тромбоцитозы

Тромбоцитоз	Причины
Реактивный	Спленэктомия, острая кровопотеря и острый гемолиз, послеоперационный период, злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, язвенный колит, остомиелит и др.
Опухолевый	Миелопролиферативные заболевания (хронический миелолейкоз, миелофиброз, эритремия, мегакариоцитарный острый и хронический лейкозы, идиопатическая геморрагическая тромбоцитемия)

Тромбоцитопении представляют собой заболевания или синдромы, при которых количество тромбоцитов снижено. Тромбоцитопении являются результатом недостаточного образования, повышенного разрушения или потребления тромбоцитов. Различают наследственные и приобретенные тромбоцитопении.

Приобретенные тромбоцитопении могут наблюдаться при гиперспленизме, инфекционных заболеваниях, хронической интоксикации любого генеза, гипер- и метапластических поражениях костного мозга, лучевой и цитотоксической терапии и сопровождаются геморрагическим синдромом. Среди приобретенных тромбоцитопений наиболее часто встречаются иммунные и аутоиммунные формы (формы, при которых тромбоциты разрушаются антителами).

Наиболее известное и распространенное заболевание этой группы - идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура. Антитела при аутоиммунной тромбоцитопении вырабатываются

против неизмененных тромбоцитарных антигенов, т. е. причиной их продукции является не изменение антигенной структуры тромбоцитов, а нарушение толерантности иммунной системы больного к собственным антигенам. Чаще всего аутоантитела бывают направлены против главных и наиболее иммуногенных белков тромбоцитов - комплекса мембранных гликопротеидов (ГП) IIb-IIIа и ГП Ib. Частота идиопатической тромбоцитопенической пурпуры составляет приблизительно 1/10000, при этом женщины заболевают приблизительно в 2 раза чаще, чем мужчины (в детском возрасте девочки и мальчики заболевают с одинаковой частотой). Развитие тромбоцитопении по аутоиммунному механизму может наблюдаться и при других патологиях, таких как системная красная волчанка и лимфопролиферативные заболевания.

Тромбоцитопатии - большая группа заболеваний и синдромов, в основе которых лежат нарушения гемостаза, обусловленные качественной неполноценностью или дисфункцией тромбоцитов.

Патогенез тромбоцитопатий изучен недостаточно. Укорочение жизни тромбоцитов объясняют дефектом структуры их мембраны или энергетики клетки, вызванной дефицитом ферментов.

Дифференциальная диагностика этих форм очень затруднена, поскольку основным и чуть ли не единственным подтверждением наследственной патологии может служить наличие семейного анамнеза, а показателем аутоиммунного генеза – обнаружение антитромбоцитарных антител.

Тромбоцитопатии делят на наследственные и приобретенные.

Приобретенные тромбоцитопатии развиваются при разнообразных патогенных воздействиях и встречаются при многих болезнях и синдромах.

Приобретенные тромбоцитопатии развиваются в основном вследствие:

• нарушения адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов (при уремии, циррозе печени, опухолях и паразитарных заболеваниях);

• потребления и структурного повреждения тромбоцитов (ДВС-синдром);

• блокады тромбоцитов протеинами (парапротеинемический гемобластоз).