2. Содержание практического занятия.
ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ
1.Познакомиться со способами стерилизации питательных сред.
2.Изучить порядок подготовки оборудования к работе.
3.Освоить технологию получения нативных культур колибактерина на основе шт. М-17.
4.Изучить порядок завершения выполнения работ на стадии.
СЫРЬЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
К РАБОТАМ ПО ПРИГОТОВЛЕНИЮ ПОСЕВНЫХ И НАТИВНЫХ КУЛЬТУР
Сырье:
Мясо-пептонный бульон РП-153-80
Питательный агар РП-153-80
Среда Эндо РП-153-80
Мясо-пептонный агар РП-153-80
Казеиновый или дрожжевой питательный агар РП-153-80
Среда высушивания РП-153-80
Натрий хлористый ГОСТ 4233
Натрий двууглекислый ГОСТ 2156
Натрий фосфорнокислый 2-х зам. ГОСТ 4172
Реактивы:
Натрия гидроокись, ГОСТ 4328
Фуксин основной, ГОСТ 1738
Йод кристаллический, ГОСТ 4159
Калий двухромовый, ГОСТ 4220
Генциан-виолет, ТУ 6-09-945-76
Фенолфталеин, ТУ 6-09-5360
Спирт этиловый, ГОСТ 5962
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709
Глицерин дистиллированный, ГОСТ 6824
Калий йодистый, ГОСТ 4232-74
Метиловый фиолетовый (метилвиолет), ТУ 6-09-945-76, чда.
Посуда:
Пробирки, ГОСТ 25336
Чашки Петри, ГОСТ 25336
Матрацы стеклянные, ТУ 64-2-181
Флаконы, вместимостью 100 дм3, ТУ 64-2-100
Колбы конические лабораторные, вместимостью, 100, 250см3, ГОСТ25336
Ступка и пестик фарфоровые, ГОСТ 9147
Материалы:
Вата медицинская гигроскопическая, ГОСТ 5556
Марля медицинская, ГОСТ 9412
Бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026
Пробки ватно-марлевые лабораторного изготовления
Масло иммерсионное СТУ 21-413
Халат медицинский
Тапочки госпитальные
Респиратор «Лепесток-200»
Перчатки хирургические
Шапочка медицинская
Оборудование:
Ферментер лабораторный, V=1,5л; V=5,0л
Насос вакуумный
Автоклав, ГОСТ 14106
Микроскоп световой биологический, ГОСТ 8284-78
Ход работы
ПОДГОТОВКА ОБОРУДОВАНИЯ (ФЕРМЕНТЕРА)
К РАБОТЕ
Подготовка ферментера включает в себя выполнение следующих операций:
ревизию всей запорной арматуры;
проверку целостности уплотнительной прокладки на крышке аппарата;
проверку наличия заземления;
проверку исправности приборов измерения температуры, рН.
ПРИЕМ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И ЕЕ СТЕРИЛИЗАЦИЯ.
Жидкую питательную среду (ЖПС) заливают в ферментер через крышку в количестве 1/2 …2/3 его полного обьема. В ферментер монтируют все необходимые датчики (температура, рН).
Питательную среду вместе с ферментером стерилизуют в автоклаве при температуре 121…123оС в течение 25…30 мин.
ЗАСЕВ МАТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ.
После стерилизации питательной среды ферментер устанавливают на пульт управления, производят все необходимые соединения (вода, сжатый воздух, вакуум). Берут пробу ЖПС для определения стерильности, рН с соблюдением правил асептики.
Затем в ферментер засевают с соблюдением правил асептики маточную культуру. Плотность посева должна составлять 400…600 млн микробных клеток в 1 мл среды.
В качестве пеногасителя используется растительное масло из расчета 1,5…3 мл на 1 л среды. Содержание ферментера перемешивают в течение 5 мин. и отбирают пробу с соблюдением правил асептики. В пробе контролируют:
отсутствие посторонних микробов;
плотность посева (по стандарту ГИСК);
количество живых клеток в 1 мл;
рН среды культивирования (при помощи рН-метра).
ВЫРАЩИВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ КУЛЬТУРЫ.
Выращивание микробов E.coli штамма М-17 производят в ферментере по следующему режиму:
температура – (37±1)оС;
перемешивание (частота вращения мешалки) – 600…1000 об/мин;
аэрация – 1…2 л/мин на 1 л среды.
В процессе культивирования в ферментер добавляют 40% раствор глюкозы в зависимости от рН среды, который должен быть в пределах 7,4…7,6 ед. рН в начале выращивания и 7,8…8,0 ед. рН в конце выращивания. При этом не допускается резких колебаний значений рН.
Каждый час из ферментера отбирают пробы для контроля:
рН среды (при помощи рН-метра, при отсутствии датчика рН);
густоты микробной взвеси.
В последней пробе контролируют дополнительно:
количество живых микробов (высев на агар в чашках Петри);
наличие посторонних микробов (микроскопией мазков, окрашенных по Граму).