4.3. Репликация/транскрипция геномов ретроидных вирусов

Ретроидные вирусы — это вирусы, репликация/транскрипция генома которых включает стадию обратной транскрипции.

Обратная транскрипция — это комплементарный синтез ДНК на матрице РНК. Осуществляется этот процесс ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой или ревертазой (обратной транскриптазой), которая впервые была обнаружена у ретровирусов. Фермент полифункционален и обладает тремя ферментативными активностями: полимеразной — способен использовать в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; активностью РНКазы Н — разрушает находящуюся в дуплексе с ДНК цепь РНК до олигомеров размером 6-12 нуклеотидов; ДНК-эндонуклеазной активностью — вносит одноцепочечные разрывы преимущественно в кольцевую форму ДНК.

Фермент состоит из двух субъединиц, присутствующих в эквимолярных количествах — малой α (p65) и большой β (p95). Альфа-субъединица обладает полимеразной активностью и активностью РНКазы Н. Эндонуклеазная активность обусловлена С-концевой областью бета-субъединицы. Ревертаза способна работать только при наличии затравки. Вопрос затравки в группе ретроидных вирусов, включающей вирусы с РНК- и ДНК-геномом, решается по-разному.

4.3.1. Репликация/транскрипция (+)РНК-генома ретровирусов

Геном ретровирусов — две молекулы кэпированной и полиаденилированной (+)РНК размером 8-10 т.н. На 5'- и 3'-концах РНК имеет прямые повторы (R), уникальные последовательности (U5 и U3, соответственно) и на 5'-конце участок присоединения тРНК (Р). В результате реакции обратной транскрипции образуются молекулы двухнитевых ДНК с длинными (несколько сотен нуклеотидов) концевыми повторами (LTR), имеющими структуру U3RU5.

При синтезе минус-нити ДНК у ретровирусов затравка необычна, ее роль выполняют клеточные транспортные РНК (тРНК). Для каждого вируса это определенная тРНК, попадающая в вирион в процессе инкапсидации геномной РНК. Реакция обратной транскрипции у ретровирусов многостадийный процесс, включающий так называемые «прыжки» — ревертазы. Возможность «прыжков» обеспечивается наличием на концах матрицы прямых повторов (R) и активностью РНКазы Н. Этапы реакции обратной транскрипции генома ретровирусов представлены на рисунке 17.

Реакция обратной транскрипции начинается не с 3'-конца, как это принято для прямой транскрипции, а с синтеза расположенного на 5'-конце короткого фрагмента путем удлинения 3'-конца тРНК. После достижения конца РНК-матрицы синтез останавливается, в связи с чем первый фрагмент (-)ДНК назван strong-stop-ДНК. На следующем этапе ревертаза в комплексе с strong-stop-ДНК совершает «прыжок» на 3'-конец матрицы, в результате которого синтезируется правый LTR.

Следует отметить, что в процессе синтеза ДНК периодически происходит смена матриц, что затрудняет ответ на вопрос, какая из двух молекул геномной РНК в данном случае является матричной. Далее ревертаза синтезирует плюс-нить правого LTR, используя в качестве затравки остаток матричной РНК в области Pu. При этом синтез продолжается за LTR и включает образование участка, комплементарного 3'-концу тРНК (область P). Этот участок обеспечивает возможность второго прыжка в ходе обратной транскрипции. По результатам реакции образуется двухнитевая ДНК протяженностью больше, чем геномная РНК за счет образования длинных концевых повторов.

Синтез вирусоспецифической ДНК происходит в составе коровой частицы в цитоплазме, затем линейная днДНК поступает в ядро клетки, где переходит в кольцевую форму. После образования кольцевой формы в местах стыка LTR возникает короткий инвертированный повтор, выполняющий функцию специфического участка интеграции. Этот участок узнается вирусным ферментом-интегразой (С-концевой участок ревертазы, обладающий эндонуклеазной активностью), который вносит ступенчатые разрывы в LTR и клеточный сайт. Этот же фермент осуществляет и воссоединение цепей ДНК. При этом оба вирусные LTR теряют по две концевые пары нуклеотидов, а участок хозяйской ДНК, куда встраивается провирус, дуплицируется.

Интеграция вирусного генома в клеточную ДНК является обязательной стадией репродукции ретровирусов. Вирусоспецифическая ДНК реплицируется вместе с клеточной ДНК при митозе и передается в дочерние клетки. Синтез ретровирусных (+)РНК происходит толь ко на матрице провирусной ДНК и осуществляется клеточным транскрипционным аппаратом, то есть, транскрипция вирусных генов является также и репликацией вирусного генома.

Синтезированные первичные транскрипты подвергаются обычным посттранскрипционным модификациям: кэпированию, полиаденилированию и сплайсингу. Сплайсингу подвергаются не все первичные транскрипты. Часть из них выходит в цитоплазму, сохраняя полную последовательность, и используется для инкапсидации в вирион. Общая стратегия репликации/транскрипции генома ретровирусов представлена на схеме 7.

Схема 7. Стратегия репликации/транскрипции генома ретровирусов

4.3.2. Репликация/транскрипция ДНК-генома гепаднавирусов

Геном вируса гепатита B представлен частично двухнитевой кольцевой молекулой ДНК размером 3,2 т.п.н., ассоциированной с молекулой ДНК-полимеразы, которая обладает ревертазной активностью. После попадания геномной ДНК вируса в ядро гепатоцита происходит репарация двухнитевой структуры ДНК и ее переход в ковалентно замкнутую кольцевую форму (cccDNA). На следующей стадии такая ДНК служит матрицей для транскрипции. В результате транскрипции образуются три класса субгеномных РНК и прегеномная РНК размером 3,4 т.п.н., что несколько длиннее, чем геномная ДНК. РНК экспортируются в цитоплазму, субгеномные мРНК транслируются, а прегеномная РНК связывается с полимеразой и инкапсидируется в коровую частицу. В составе коровой частицы ДНК-полимераза осуществляет синтез минус-нити ДНК на матрице РНК по механизму самопраймирования. В процессе синтеза происходит деградация матричной РНК. Синтез минус-нити ДНК начинается вблизи 3'-конца прегеномной РНК, вследствие чего 5'-конец негативной ДНК становится связанным с ревертазой.

После завершения синтеза минус-цепи ДНК и удаления основной части матричной РНК остается кэпированный 5'-конец РНК, содержащий копию участка инициации синтеза ДНК (DRI). Этот фрагмент РНК переносится на 3'-концевой комплементарный участок минус-нити ДНК (DR2) и служит затравкой для синтеза плюс-нити ДНК. Затем ДНК-полимераза синтезирует неполную плюс-нить ДНК и геном или реимпортируется в ядро или происходит созревание коровой частицы до инфекционного вириона. Общая стратегия репликации/транскрипции генома гепаднавирусов может быть представлена в следующей схеме (схема 8).

Существует еще несколько вирусов, у которых репликация генома также включает реакцию обратной транскрипции. Это каулимовирусы (вирусы растений), имеющие геном в виде двухнитевой кольцевой ДНК, обе нити которой не непрерывны. Стратегия репликации генома каулимовирусов сходна с репликацией/транскрипцией ДНК гепаднавирусов.

Схема 8. Стратегия репликации/транскрипции генома гепаднавирусов

Таким образом, стратегии репликации/транскрипции (+)РНК-геномных ретровирусов и ДНК-геномных гепаднавирусов позвоночных и каулимовирусов растений имеют общую основу — механизм обратной транскрипции, и это сходство, по всей вероятности, имеет эволюционную основу.