Глава 4. Молекулярные аспекты репродукции вирусов

4.1. Репликация геномов вирусов

Репликация вирусных геномов — это матричный комплементарный синтез нуклеиновых кислот, преследующий целью наработку геномных последовательностей для их последующей инкапсидации в вирион.

ДНК-геномы реплицируются клеточными или вирусоспецифическими ДНК-полимеразами. РНК-геномы реплицируются вирусоспецифическими РНК-полимеразами, которые также являются и транскриптазами. Репликация вирусных геномов происходит или одновременно с транскрипцией, или эти два процесса разделены во времени.

Механизмы репликации вирусных геномов различны и определяются видом генома. Существует три модели репликации — полуконсервативная, консервативная и дисперсная. Консервативная и дисперсная модели репликации нуклеиновых кислот установлены только у вирусов.

Полуконсервативная модель предполагает, что после первого раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних молекул является родительской, другая — синтезируемой заново. По такой схеме репликацируются днДНК-геномы.

При реализации консервативной модели репликации одна дочерняя молекула состоит из двух родительских цепей, а другая — из вновь синтезированных цепей. Согласно консервативной модели реплицируются двухнитевые РНК реовирусов. ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся таким образом, неизвестны.

Дисперсная модель репликации приводит к образованию молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из фрагментов как родительских цепей, так и вновь синтезированных. Дисперсная модель реализуется на промежуточной стадии репликации онДНК генома парвовирусов.

Единицей репликации является так называемый репликон — нуклеотидная последовательность, расположенная между точкой начала репликации (origin) и точкой окончания репликации (terminus). Процесс репликации ДНК разделен на три стадии: инициация цепи, элонгация (удлинение) цепи и терминация.

4.1.1. Репликация ДНК-геномов вирусов. Общие принципы репликации

Инициация синтеза цепи ДНК может происходить только при наличии затравки для ДНК-полимеразы. Вид затравки и способ ее образования различаются у разных вирусов и определяют своеобразие вирусных репликативных систем. Различают три основных способа инициации синтеза ДНК:

Инициация на внутренних участках ДНК — характерна для кольцевых матриц. Затравкой служит олигорибонуклеотид, который может быть синтезирован ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой. Эти ферменты могут иметь клеточное происхождение, или быть вирус-специфическими. Синтезироваться может одна затравка или несколько затравок.

На однонитевой матрице затравка синтезируется на определенном участке, узнаваемом ферментом. Двухнитевая матрица сначала подготавливается к инициации. На участке ori происходит присоединение хеликазы. Этот фермент расплетает участок матрицы, что приводит к образованию репликативной вилки с последующим синтезом затравки.

Инициация на концах ДНК (терминальная инициация) — характерна для линейных матриц. Различают две группы способов концевой инициации ДНК-синтеза: с использованием нуклеотидбелковой затравки и с использованием самозатравочного механизма.

Инициация синтеза с использовании разрывов и брешей — затравкой для дальнейшего удлинения цепи может быть 3'-ОН конец разорванной цепи ДНК.

Элонгация цепи при репликации вирусных геномов принципиально не отличается от процесса синтеза клеточных ДНК. Используются ферменты, вспомогательные белки и репликационные белки, принадлежащие как клетке хозяина, так и вирусу. Синтез ДНК, как правило, осуществляет ДНК-зависимая ДНК-полимераза II, в редких случаях — ДНК-полимераза III. Основным свойством синтеза является его полярность, при которой очередной нуклеотид присоединяется к 3'-концу растущей цепи. То есть направление синтеза идет от 5'- к 3'-концу, считывание - от 3'- к 5'-концу. Особенности синтеза комплементарных нитей связаны со способом инициации. На днДНК матрице синтез идет через образование репликативной вилки или с вытеснением цепи, на онДНК-матрице — по-репарационному механизму.

Стандартный механизм полуконсервативной репликации ДНК с образованием репликативной вилки включает следующие стадии:

1. Инициация репликации расплетением днДНК хеликазой. Репликация начинается не в случайной точке, а в специфическом месте, называемом точкой начала репликации (ori), которых может быть одна или несколько.

2. Синтез РНК-затравки ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой.

3. Синтез комплементарных цепей ДНК-полимеразой (II, III). Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения дезоксинуклеотидов к 3'-концу растущей цепи, то есть в направлении от 5'- к 3'-концу вдоль матричной цепи. Синтеза цепей в обратном направлении не происходит. Поэтому синтезируемые цепи в репликативной вилке растут в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно — это ведущая, или лидирующая цепь. Синтез другой цепи идет импульсами — это отстающая цепь. Лидирующая цепь синтезируется в направлении роста репликативной вилки, отстающая — в обратном направлении в результате нескольких актов инициации. В итоге образуется несколько коротких цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи. Механизм репликации лидирующей и отстающей цепей в принципе одинаков и требует синтеза коротких РНК-затравок, комплементарных матричной цепи. Скорость копирования в репликативной вилке постоянна и равна 1,5 т.п.н./сек.

4. Дезинтеграция РНК-затравки РНКазой Н.

5. Сшивание фрагментов Оказаки ДНК-лигазой.

6. Снятие сверхспирализации топоизомеразами (топоизомераза I — вносит разрывы в одну цепь, топоизомераза II — вносит разрывы в обе цепи).

Терминация синтеза

1. Терминация синтеза и расхождение кольцевых геномов упрощены, поскольку синтез цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3'- и 5'-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой.

2. В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3'-концом и пробелом на 5'-конце. Предложено 2 способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи (рис. 10).

Рис. 10. Схемы терминации синтеза линейных ДНК через образование конкатемеров (А) и через образование шпильки (Б)

В 1972 г. Уотсон предложил модель завершения репликации ДНК с прямыми повторами на концах через образование конкатемеров, которые представляют собой несколько тандемно-повторяющихся единиц генома. После образования конкатемера специфическая эндонуклеаза вносит ступенчатый разрыв в месте воссоединения. Это приводит к образованию выступающих 5'-концов и пробелов на 3'-конце, которые наращиваются ДНК-полимеразой. Бреши закрываются или путем репарации или лигирования.

Синтез полноразмерных линейных ДНК с инвертированными повторами на концах может быть завершен через образование шпильки. Инвертированные повторы — это две копии одной и той же последовательности ДНК в составе одной молекулы, находящиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу инвертированные повторы образуют палиндромы. На рисунке 10 показано, что терминация 3'-конца через образование шпильки включает лигирование 3'-конца шпильки с 5'-концом комплементарной цепи, внесение одноцепочечного разрыва с образованием выступающего 3'-конца и его удлинение.

Основные схемы репликации ДНК-геномов