3.2 Биофизические методы получения накопительных культур
Использование терморезистентности спор для получения
мезофильных бактерий Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus
Для получения накопительной культуры Bacillus subtilis 10 г сена измельчить, залить водой (100 г), закрыть пробкой и кипятить в течение 10 мин. Затем культивировать в термостате при 20-30 С в течение 2-3 дней. На поверхности суспензии вырастает серо-белая пленка из палочек B.subtilis.
Вынимая колбы через 1, 2, 3 суток, наблюдают различные стадии сенной палочки: стадию молодых подвижных клеток; стадию зооглеи; спорообразование (спороносные клетки и зрелые высыпавшиеся споры).
Bacillus mesentericus – картофельная палочка. Для получения накопительной культуры истертый в кашицу картофель поместить в пробирку или колбу, прогреть на водяной бане при 100 С в течение 30 мин и оставить стоять. На картофеле образуется плотная морщинистая пленка, состоящая из палочек B.mesentericus. Проследить стадии развития картофельной палочки.
1
2
Морфология клеток и спор бактерий Bacillus subtilis
(1- цепочка клеток; 2 – спора в клетке)
Некоторые признаки, используемые для идентификации бактерий
Идентификация – это определение систематического положения микроорганизмов, выделенных в чистые культуры.
Для установления семейства, рода, вида, к которому принадлежат выделенные бактерии, необходимо изучить их морфологические, культуральные и физиологические признаки. При этом необходимо соблюдать следующие правила:
- быть уверенным в чистоте исследуемой культуры;
- для контроля иметь культуру, которую сохранять и не использовать для засева других сред;
- опыты по выявлению физиолого-биохимических признаков проводить не менее трехкратной повторности.
6.1 Морфологические и цитологические признаки
Для определения вида бактерий должны быть изучены форма, размеры и строение клеток, Для выявления цикла развития и предварительной идентификации необходимо последовательное микроскопическое наблюдение за культурами разного возраста (6-26-48-72 часа, 5-7 суток).
Учитывают признаки:
- форму клеток (кокк, палочка - прямая, изогнутая, вибрион, спирилла);
- характер взаимного расположения (одиночные клетки, соединенные попарно, нити, кубики);
- размеры клеток (в микрометрах);
- форму концов клеток (закругленные, заостренные, срезанные под углом, вогнутые);
- наличие спор, их форму (круглая, эллипсовидная, продолговатая);
- размеры и расположение спор внутри клетки (центральное, полярное);
- подвижность;
- наличие или отсутствие капсул;
- цитологию клеток (зерна волютина, включения жира, гликогена).
6.2 Культуральные признаки
Культуральные признаки устанавливают по характеру роста культуры изучаемого микроорганизма на плотных и жидких питательных средах. В большинстве случаев при определении вида гетеротрофных микроорганизмов используют обычные лабораторные среды: мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, мясо-пептонную желатину, ломтики картофеля. На этих средах развитие микробов каждого вида имеет свои характерные особенности, таким путем выявляются культуральные свойства вида.
Рост на мясо-пептонном агаре
Должны быть учтены форма колоний, развивающихся на МПА и характер штриха на скошенном агаре. При описании поверхностных колоний характеризуют следующие признаки.
Рост: медленный, быстрый. Общая форма колоний: затягивающий, крупные (размер), мелкие (размер), точечные (1мм). Сплошные, волокнистые, хлопьевидные, корневидные. Круглые, неправильной формы.
Характер края: гладкий, волнистый, лопастный, разорванный, зубчатый, неправильно изрезанный, бахромчатый, ворсистый, нитчатый, локонообразный.
Поверхность: гладкая, шероховатая, складчатая, бороздчатая, концентрически или радиально исчерчена. Блестящая, матовая, мучнистая.
Профиль: пленчатый, плоский, приподнятый, выпуклый, сильно выпуклый (в виде булавочной головки), рогообразный.
Внутренняя структура (при малом увеличении микроскопа): однородная, мелко (крупно) зернистая, чешуйчатая, неправильно пятнистая, струйчатая, локонообразная, радиально-концентрически исчерченная.
Цвет колонии.
Описание характера роста по штриху приводят, когда рост кончился. Прежде всего отмечают следующие признаки.
Мощность роста: обильный, умеренный, скудный.
Характер посевной черты: налет сплошной (с ровными и волнистыми краями, четковидный (в виде цепочки изолированных колоний), диффузный, перистый, древовидный, ризоидный.
Характер края черты: гладкий, волнистый, мелкозубчатый, лопастный, неправильно изрезанный, волосистый, реснитчатый, ветвистый.
Поверхность штриха: блестящая, матовая, мучнистая.
Консистенция: штрих сочный, сухой, кожистый, тянущийся, слизистый, хрящеватый.
Профиль штриха: пленкообразный, плоский, выпуклый.
Оптические признаки: рост непросвечивающий, просвечивающий, опалесцирующий, иризирующий.
Цвет налета, изменение цвета cреды.
Определение Грам-принадлежности
Метод Грезерсона. Клетки культур (лучше 1-2-суточные) помещают петлей в каплю 3%-го раствора КОН на предметное стекло, размешивают круговыми движениями и через 5-8 с петлю резко поднимают. Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за петлей, образуя тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде). Реакцию считают отрицательной, если образование слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе щелочи и освобождением ДНК.
Обнаружение каталазы
Каталаза относится к классу оксидоредуктаз и катализирует расщепление перекиси водорода до воды и молекулярного кислорода.
Для обнаружения каталазы выросшую культуру снимают с поверхности агара неметаллическим инструментом и суспензируют в капле 3 %-ной перекиси на предметном стекле. Через 5 мин наблюдают за образованием пузырьков.