8

План отчета:

1. Методы выделения микроорганизмов

2. Получение чистой культуры

3. Характеристика микроорганизмов (описание признаков и рисунок или фото)

Методы получения накопительных и чистых культур бактерий

В условиях естественного обитания чистые бактериальные культуры встречаются довольно редко. Тем не менее исследование физиолого-биохимических и морфологических особенностей бактерий возможно только при работе с чистыми культурами. Поэтому часто возникает необходимость выделить в виде чистых культур различные виды бактерий, которые сосуществуют в естественных условиях.

Чистой культурой микроорганизмов называют культуру, полученную из одной клетки. Выделению чистой культуры, как правило, предшествует получение накопительной культуры, т.е. культуры, обогащенной микроорганизмами с желаемыми свойствами. Накопительными называют такие культуры, в которых преобладают представители одной группы или даже одного вида микроорганизмов. Поэтому разработанные методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного микроорганизма благодаря созданию лучших условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его от других членов популяции.

Условия, обеспечивающие преимущественное развитие определенной группы или вида микроорганизмов, называются элективными. При создании элективных условий учитывают особенности физиологии и обмена веществ микроорганизмов: требования их к источникам питания, отношение к кислотности среды, аэрации, температуре, способность к образованию эндоспор и др. Особенно часто элективные условия создают путем подбора соответствующей для выявляемых микроорганизмов среды. Элективные условия не всегда оптимальны для роста исследуемого организма, но они все же лучше переносятся ими, чем сопутствующими формами. Учение об элективных средах создано С. Н. Виноградским и основано на экологических принципах. В некоторых случаях используют метод "отрицательной" селекции и так называемые селективные среды, в которые вносят избирательно действующие ингибиторы. Например, на питательной среде с азидом натрия (концентрация 0.02) в аэробных условиях достаточно хорошо развиваются молочнокислые бактерии, тогда как рост аэробных микроорганизмов подавлен.

Различают биофизические, биохимические и биологические методы получения накопительных культур. К биофизическим методам следует отнести регуляцию роста температурой, тепловую обработку и ультрафиолетовое облучение, приводящие к гибели или подавлению роста других организмов, которые присутствуют в популяции. Можно также использовать преимущества некоторых физических свойств изучаемого организма, таких как его размеры и подвижность; это позволяет в значительной мере отделить данный микроорганизм от других в популяции. В биохимических методах используют токсические вещества, которые убивают или подавляют рост оставшейся части популяции, не влияя на выделяемый организм. Кроме того, эти вещества могут быть источниками питания, используемыми преимущественно отдельными бактериями в смешанной популяции. Биологические методы включают использование специфических хозяев для выделяемого организма, а также преимуществ некоторых патогенных свойств микроорганизма (например его инвазивность), которыми не обладают другие представители популяции. Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления сочетают биофизические, биохимические и биологические методы.

Из накопительной культуры получают чистую. Существует несколько методов получения чистых культур. Все они основаны на выделении из популяции одной единственной клетки. Чаще других используется метод, предложенный Кохом. Метод заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии, которую считают результатом развития одной клетки. Для получения изолированных колоний накопительную культуру аэробных микроорганизмов высевают на поверхность плотной питательной среды. Рассев проводят петлей или шпателем. Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося клетки в отдельные пробирки с жидкой средой. Изолированные колонии микроорганизмов, относящихся к факультативным анаэробам, чаще получают при глубинном посеве. При выделении чистой культуры анаэробных микроорганизмов по методу Коха требуется создание условий, ограничивающих доступ кислорода к культуре. Для этого делают разведения накопительной культуры в пробирках с предварительно расплавленной и остуженной до 45-50 С агаризованной средой. После застывания агара поверхность среды заливают смесью парафина и вазелинового масла (1:1). При удачно выбранном разведении накопительной культуры развиваются отдельные колонии.

Иногда достаточно одного посева на плотную питательную среду, чтобы получить чистую культуру. Однако чаще посев повторяют два-три раза. В качестве посевного материала при этом используют культуру, полученную из отдельной колонии. К выделению чистой культуры можно приступить в том случае, если через несколько пересевов на микроскопическом препарате будет преобладать необходимый вид микроба.

Существует несколько методов выделения чистых культур. Они основаны на принципе механического разобщения бактерий на поверхности агаровой пластинки, чтобы при их выращивании получились изолированные колонии (колония – потомство одной бактериальной клетки). Наиболее часто используют метод Коха.

Первый этап. Рассев накопительной культуры. Для этого 150 мл стерильной РПА разлить в 6 стерильных чашек Петри. Посев провести поверхностным способом, распределяя посевной материал по агаровой пластинке стерильным стеклянным шпателем. Сделать два высева: непосредственно из накопительной культуры и из разведения ее в стерильной водопроводной воде. Для приготовления разведения внести стерильной пипеткой одну каплю накопительной культуры в пробирку с 8-10 мл стерильной воды и тщательно перемешать. В обоих случаях количество посевного материала – петля суспензии ("зеркальце"). Этот объем внести на застывшую агаризованную среду в первую чашку, распределить его стерильным шпателем по всей поверхности среды, а затем этим же шпателем провести последовательно по поверхности среды еще в двух чашках Петри. Чашки поместить в термостат на 30 С крышками вниз. Продолжительность культивирования – 3-5 суток.

Второй этап. Описание и отсев выросших колоний. Просмотреть колонии микроорганизмов, выросшие в чашках Петри. Отметить, описать и зарисовать преобладающую форму, выбирая изолированные колонии. При описании колоний чашки Петри не открывать. Консистенцию определить при отсеве колоний. Признаки колоний записать в таблице. После этого отсеять изолированную колонию в две пробирки на поверхность скошенного РПА и поставить в термостат на 30 С на 3-5 суток.

Третий этап. Проверка чистоты выделенных культур. Чистоту выделенных культур проверяют визуально, микроскопированием и рассевом на поверхность агаровой пластинки в чашках Петри.

Визуальный контроль. Просматривают рост по штриху на скошенной агаризованной среде. Для дальнейшей работы оставляют культуры, рост которых однороден по всему штриху. Если рост культуры по штриху неоднороден, культуру считают загрязненной и отбрасывают.

Микроскопический контроль. Готовят препараты фиксированных окрашенных клеток или препараты живых клеток. Последние микроскопируют, лучше с фазово-контрастным устройством. Чистые культуры морфологически однородны, допустимо лишь некоторое варьирование размеров клеток. Во многих случаях загрязнение культур посторонней микрофлорой выявляется уже с помощью микроскопического контроля. Загрязненные культуры отбрасывают.

Рассев на плотную среду. Это наиболее надежный способ проверки чистоты культур. Культуру пересевают в пробирку со свежей скошенной средой РПА. Затем готовят суспензию культуры смывом стерильной водопроводной водой. Полученную суспензию можно использовать для микроскопического контроля. Чистая культура характеризуется однородностью клеток и колоний.