Принципиальная схема лабораторной диагностики вирусных и риккетсиозных инфекции

I этап – забор исследуемого материала

1) От больного: носоглоточные смывы, испражнения, спинномозговая жидкость, кровь, отделяемое конъюнктивы глаз, содержимое папул, везикул, пустул.

2) От трупа: кусочки органов и тканей, содержимое кишечника, кровь из полости сердца, спинномозговая жидкость.

3) В очаге: трупы павших животных или кусочки органов и тканей от них, кровососущие насекомые, клеши, вода и т.д.

Вирусоскопия	Вирусология	Серодиагностика
Цель - обнаружение вируса в исследуемом материале. Методы: 1.Риноцитоскопия (выявление внутриклеточных включений – косвенное обнаружение вирусов. По Пигаревскому; по Морозову. 2. Прямая РИФ. Люминесцентная микроскопия (обработка препаратов аурамином позволяет дифференцировать РНК-содержащие (красное свечение) и ДНК-содержащие (зеленое свечение) вирусы) 3.Электронная микроскопия для изучения ультраструктуры вирусов.	Цель — накопление вируса и его идентификация. Исследуемый материал обрабатывается антибиотиками для уничтожения сопутствующей микрофлоры или пропускается через фильтры. Для репродукции вирусов существует 3 живые системы (модели). II этап — накопление Курин.эмбр. Культ. Лаб. жив. клеток III этап – обнаружение вируса (индикация) РГА или ЦПД Клин. прояв. гибель или гибель IV этап - идентификация (сероидентификация) РТГА, РСК РН, РП, ИФА, РНГА,РН и т.д.	Цель – изучение парных сывороток больного с целью выявления динамики нарастания титра специфических Ig (за положительный титр принимается 4-х кратное нарастание титра антител). РТГА РСК РП РН ИФА РНГА

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Лабораторная диагностика проводится в трёх направлениях:

1. Вирусоскопическое исследование (выявление внутриклеточных включений, вызванных репродукцией вируса, люминесцентная микроскопия, электронная микроскопия).

Внутриклеточные включения формируются в заражённых вирусом клетках — это места синтеза и сборки вирусных структур. Они являются продуктами взаимосодействия вируса и клетки. Внутриклеточные включения могут быть в цитоплазме и в ядрах зараженных вирусом клетках. По форме включения могут быть округлыми, кристаллоподобными, в виде тяжей и т.п. Для идентификации внутриклеточных включений (принадлежности к тому или другому вирусу) часто используют различные серологические реакции (РИФ, ИФА, РИА, ПЦР, метод молекулярной гибридизации, метод иммуноэлектронной микроскопии и др.).

2. Вирусологическая диагностика, включающая накопление вируса в живых системах (куриный эмбрион, лабораторное животное и различные культуры клеток), индикацию накопленного вируса в живых системах и идентификацию выделенного вируса с помощью серологический реакций, позволяющих установить антигенную структуру выделенного вируса.

Вирусы обладают тропизмом к определённой ткани организма и поэтому в одних клетках репродукция вируса сопровождается гибелью клетки (очаговую мелкозернистую деструкцию вызывают вирусы гриппа, клещевого энцефалита, а гроздевидную дегенерацию - аденовирусы) — цитопатическим действием (ЦПД), а в других клетках вирус репродуцируется, а гибели клеток не наблюдается. Поэтому, в первом случае, индикация вируса проводится по ЦПД, бляшкообразующей активности (способность вируса разрушать клетки под слоем агара или на поверхности хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона) или гибели лабораторного животного. Во втором случае, наличие вируса определяют по выявлению поверхностного гемагглютинирующего антигена вируса. Для этого исследуют аллантоисную жидкость куриного эмбриона, культуральную жидкость (питательная среда для роста клеток, в которые был внесён для накопления вирус) и т.п. Гемагглютинирующий антиген вируса определяют с помощью постановки реакции гемагглютинации (РГА). Если вирус не разрушает клетки, но репродукция его происходит, то репродукцию вируса определяют по феномену гемадсорбции — клетки, продуцирующие вирус клетки адсорбируют на своей поверхности эритроциты крови различных лабораторных животных. Идентификацию выделенного вируса проводят на основании выявления антигенной структуры выделенного вируса. Для этого используют антитела к различным антигенам вируса и ставят серологические реакции: РСК, РТГА, РН (реакция нейтрализации), РП, РПНА (реакция подавления нейраминидазной активности вируса), ИФА, РИА и др.

3. Серодиагностика — постановка диагноза заболевания на основании иммунобиологической перестройки в организме. Для этого используются различные серологические реакции, позволяющие выявить в крови больных людей или реконвалесцентов циркуляцию различных классов иммуноглобулинов к определённым антигенам вирусной частицы.

При проведении серодиагностики определяют суммарные иммуноглобулины. В этом случае кровь больного (реконвалесцента) исследуют в динамике с интервалом 10-14 дней. Для постановки диагноза заболевания необходимо, чтобы концентрация антител в крови возросла не менее, чем в 4 раза. Кроме этого в крови определяют различные классы иммуноглобулинов к антигенам вирусных частиц. В этом случае используют обычно однократное исследование сыворотки крови больного.

Серодиагностика при гриппе имеет ретроспективное значение и предназначена для подтверждения результатов вирусологических исследований с целью решения вопроса о выборе вакцинного препарата для иммунизации угрожаемых контингентов населения. Определяют подтип вируса гриппа, вызвавшего эпидемию или пандемию.

Достоверное нарастание титров антител к вирусам гриппа отмечается на 2-3 неделе после перенесённого заболевания. В РСК парные сыворотки исследуют одновременно с вирусами трех типов. РСК более чувствительна, чем РТГА, и позволяет диагностировать грипп в очагах до 90% случаев.

РТГА применяется для определения подтипа штамма вируса гриппа, тип которого был определен в РСК. РН применяют в основном для установления штаммовой принадлежности вируса гриппа.

В последнее время для серодиагностики гриппа и др. вирусных инфекций применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, позволяющий выявить и титровать специфические противовирусные антитела в сыворотках людей и ставить диагноз в 75% случаев.

РПНА (реакция подавления нейраминидазной активности) используется для идентификации новых штаммов вирусов гриппа. Для изучения антигенной структуры вирусов гриппа используют реакцию иммуноадсорбции, метод радиоиммунного анализа и иммуноэнзимный метод.

Для диагностики парагриппозной инфекции ставят РТГА с 4 антигенами (типовыми) парагриппозных вирусов. В реакции используют эритроциты морских свинок.

Серодиагностика аденовирусных заболеваний проводится на основании нарастания титра антител в парных сыворотках больных и реконвалесцентов. Применяется реакция нейтрализации вируса в культуре клеток, РСК, РТГА. Комплементсвязывающие антитела появляются с 10-15 дня болезни, носят группоспецифический характер и сохраняются несколько лет. Эту реакцию сложно использовать для выявления свежих случаев заболевания, т.к. многие люди имеют постоянно высокие титры антител к аденовирусам. Это связано с тем, что все аденовирусы имеют единый комплементсвязывающий антиген. РН и РТГА ставят с эталонными типами аденовирусов. Четырехкратное нарастание типоспецифических антител свидетельствует об установлении типа аденовируса.