Объект и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали пчелиные семьи и отдельные особи медоносной пчелы (Apis millifera millifera L). Семьи содержали по технологиям, принятым в пчеловодстве, в типовых ульях.
Определение видового состава меда
Для приготовления препаратов из меда использовалась методика А. Маурицио и Ж. Луво (A.Mauricio et J. Louveax, 1965). 10 г меда заливали 20 мл холодной дистиллированной воды и ставили в водяную баню с температурой до +45 °С до полного растворения меда. Затем раствор центрифугировали в центрифуге ОЛМЦ в течение 15 мин со скоростью 2400 об/мин. После этого жидкость сливали, а осадок переносили на предметное стекло. После незначительного подсыхания капли пыльцу фиксировали 96%-ным спиртом, окрашенным фуксином.
Пыльник помещали на предметное стекло, нанося на него 2-3 капли 96%-ного спирта, после чего добавляли 2-3 капли дистиллированной воды и подогревали стекло до полного исчезновения влаги. Затем препаровальной иглой разрушили оболочку пыльника, а пыльцевые зерна фиксировали на 2-3 капли 96%-ным спирта, слабо окрашенного фуксином.
Пергу, извлеченную из 15 ячеек с разных участков сота, помещали в чашку Петри, заливали дистиллированной водой и выдерживали в течение 3 ч. до её полного размягчения. После размягчения пергу осторожно перемешали стеклянной палочкой. Через 20-30 мин. жидкость сливали, а из осадка делали мазок на обезжиренном предметном стекле.
Процентное соотношение видового состава пыльцы в препаратах из перги и меда определяли под микроскопом Миктрон, подсчитывая не менее 200 пыльцевых зерен и одновременно определяя их видовую принадлежность.Анализ проводился с выполнением требований ГОСТ Р 52940-2008 «Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен».
Определение содержания ТМ.
Забор проб на ТМ (почва, растения, пчелы и мёд) производился на 3 кочевых пасеках, располагающихся на полях засеянных гречихой (Fagopyrum esculentum Moenh), примерно через 20 дней после прибытия их на медосбор. Автомагистраль М5 «Урал» Москва – Уфа – Челябинск (проба № 1 Благоварский район РБ) - дорога 1-й категории (интенсивность движения - 12700 ± 2500 автомобилей в сутки). Пасека располагалась примерно в 400 м от автомагистрали. Проба № 2 - пасека в 300 м от автотрассы 3-й категории Стерлитамак – Киргиз-Мияки в Стерлибашевском районе Республики Башкортостан (2200 ± 440 автомобилей в сутки). Контроль (проба 3) пасека в 8 км от автомагистрали Стерлибашево – Федоровка (4 категории, с интенсивностью движения 450 ± 60 автомобилей в сутки).
Отбор проб почвы для анализов проводился в соответствии с требованиями к отбору почв при общих и локальных загрязнениях, изложенными в МУ 2.1.7.730–99 «Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест» и в ГОСТ 17.4.3.01–83 (СТ СЭВ 3847–82) «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб».
У растений гречихи для исследования содержания ТМ брали надземную и корневую часть. Корни промывали проточной водой. Растения сушились в затененном месте до постоянного веса.
От 5-10 пчелосемей отбирали примерно по 100 пчел от каждой, которых помещали в садки и потом замораживали при температуре – 18 °С.
Пробы мёда брали непосредственно из магазинных рамок. Мёд отбирали стеклянной палочкой или чайной ложкой из разных мест сота. В каждой пробе было не менее 100 г меда, который помещали в чистую стеклянную посуду.
Содержание ТМ (свинец, кадмий, железо, цинк, медь, ртуть) в пробах определяли при помощи атомно-адсорбционной спектрометрии на анализаторе ААС-30. Метод основан на минерализации образца в муфельной печи, переведении в солянокислый раствор с последующей атомизацией растворов золы в пламени ацетилен-воздух и определении элемента по величине адсорбции света, испускаемого селективными лампами с полым катодом. Чувствительность определения тяжелых металлов в растворах составляет 0,1%.
Расчет индекса аккумуляции (Jа или ИА), который определяется соотношением количества ТМ в следующих друг за другом звеньях изучаемой цепи (например, растение → почва), проводился по формуле Jа = ср : сп, где ср – концентрация ТМ в растении, сп – концентрация ТМ в почве (Башмаков, Лукаткин, 2002).
Определение коэффициента перехода вещества (КПВ) ТМ указывает на то, какова доля вещества, имеющегося в почве, достигает конечного продукта (мёда) изучаемой нами трофической цепи. Расчёт проводится путём определения процентной доли вещества почвы достигшей мёда: КПВ = (ТМмёда : ТМпочвы) × 100 %.
Определение содержания фитогормонов
Нектар собирали капиллярным методом или использовали для данной работы пчел. Для этой цели отбирали сильную пчелиную семью, которую размещали её в непосредственной близости от изучаемого медоноса за несколько дней до сбора нектара. Формировали гнездо пчелиной семьи следующим образом: накануне сбора нектара с помощью рамок заполненных медов максимально укомплектовывали гнездо за исключением места для одной рамки, которая не содержит меда. Рано утром устанавливали данную рамку для сбора нектара пчелами и вечером после захода солнца отбирали данную рамку. С помощью микропипетки собирали нектар из сотов и замораживали при температуре – 18 ºС и ниже. Для проведения анализов необходимо не менее 3-5 мл нектара. Сбор пыльцы проводят с помощью пыльцеуловителей, отбирали среднею пробу по общепринятым методикам. Перга извлекалась из сот, замораживалась, отмывалась от меда и воска, затем сушилась. Для проведения анализов необходимо не менее 3 г пыльцы или перги. Отбор средней пробы меда проводили стеклянной палочкой. Для проведения анализов необходимо не менее 5 г меда.
Определение фитогормонов проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) по модифицированной нами схеме (Фархутдинов и др., 2010).
Для изучения путей распространения аскосфероза нами была разработана следующая схема исследований:
Пчелиные семьи с клиническими признаками аскосфероза выявляли в период проведения весенней ревизии (начало мая) пасеки. Для проведения микроскопических исследований и выделения чистой культуры гриба в стерильные пробирки было отобрано по 10-15 мумифицированных личинок, которые гомогенизировали и просматривали в световом микроскопе при увеличении х 400. При наличии в поле зрения характерных для A.apis шаров, заполненных спорами, делали посев гомогената на картофельно-декстрозный агар с дрожжевым экстрактом (Жуков, 1995). Идентификацию выросших колоний гриба проводили по общепринятым методикам.
При изучении микобиоты растительного объекта был выбран одуванчик лекарственный (Taraxacum officinalis L.), обильно произрастающий на территории продуктивного лёта пчёл. Собирали распустившиеся цветки (10 шт.) в стерильные колбы объемом 100 см3, заливали их 20 см3 стерильного физиологического раствора, аккуратно встряхивали колбу в течение 2-3 минут, полученные смывы переносили в центрифужные пробирки, центрифугировали при 2000 об/мин – 15 минут, надосадки сливали, а осадки использовали для посева на питательные среды по общепринятым методикам.
Пыльцевая обножка отбиралась по цвету (Фархутдинов и др., 2010), для подтверждения выборочно проводился пыльцевой анализ с помощью микроскопа и сравнивали наблюдаемое изображение со стандартом пыльцы одуванчика. Пыльцевая обножка (около 10 г), взятая из пыльцесборника, измельчалась в фарфоровой ступке и 1 мл взвеси распределялся по поверхности питательной среды и посевы помещались для культивирования в термостат.
Оценку степени зараженности рабочих пчёл больных семей спорами гриба проводили отлавливая фуражирующих пчел у летков по 10 шт. в стерильные пробирки. Для обездвиживания их помещали в морозильную камеру холодильника на 20-30 минут, затем заливали 5 мл стерильного физиологического раствора, делали смывы, центрифугировали как указано выше, и полученные осадки высевали на питательные среды.
Выделение спор гриба A.apis из меда проводили согласно «Методическим рекомендациям по изучению и разработке способов профилактики и борьбы с аскосферозом пчел» (1987). Известно, что по встречаемости в микобиоте пыльцевой обножки доминирует род Aspergillus, а к случайным относится род Ascosphaera (Осинцева, Чекрыга, 2008). Так как в нашей работе мы проводили экспресс-тестирование по определению количества зараженных микозами объектов в изучаемой нами системе, мы допускаем возможность ошибки в определении количества зараженных объектов только родом Ascosphaera или комбинированно родами Aspergillus + Ascosphaera. Более того, как показывают данные литературы и наши наблюдения, оба возбудителя часто действуют сочетанно.
Статистическую обработку проводили по стандартным программам MS Excel. Все эксперименты повторяли не менее трех раз. На графиках и в таблицах указано количество биологических повторений (n), приведены средние значения показателей и ошибки средних.