13

Московская государственная академия ветеринарной

медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина ______________________________________________________

Кафедра ветеринарной вирусологии

Контрольная работа по вирусологии вариант № 17

Фроловой О.А., студентки

4-ого курса, 2-ой группы,

факультета ветеринарной

медицины, заочной формы

обучения.

Шифр: 0256

Проверил: ________________________________________

Москва, 2004 содержание

1. Что представляют собой живые противовирусные вакцины?

Принцип их действия, достоинства и недостатки.

Назовите некоторые из живых вакцин………………...……..…………………3

2. Назовите методы, с помощью которых можно обнаружить противовирус-ные антитела в сыворотке и определить их титр……………………………….7

3. В птицеводческом хозяйстве заболели куры. Заболевание протекало со следующими клиническими признаками: угнетение, отказ от корма, снижение яйценоскости, кашель; затрудненное дыхание, сопровождающееся хрипами. У некоторых птиц слезотечение. Гибель – 2 %.

При вскрытии павших птиц установлено: в просвете гортани и трахеи казеозные пробки, слизистая оболочка трахеи воспалена, гиперемирована, нередко с кровоизлияниями, слизистая оболочка глаз воспалена и отечна.

Какое (или какие) вирусное заболевание можно предполагать на основе приведенных данных?

Какой материал надо взять от больного животного для лабораторного исследования?

Правила его транспортировки в лабораторию.

Каковы цели, методы и последовательность лабораторных исследований взятого Вами патологического материала?……………………………………11

4. Список использованной литературы…………………………………………..13

1. Что представляют собой живые противовирусные вакцины? Принцип их действия, достоинства и недостатки. Назовите некоторые из живых вакцин.

В то время как большинство бактериальных инфекций удается лечить с помощью антибиотиков, удовлетворительных методов лечения вирусных заболеваний практически не существует. Самым простым и надежным методом борьбы с вирусными инфекциями является иммунопрофилактика (вакцинация).

Вирусы столь малы и просто устроены, что могут размножаться только используя многочисленные макромолекулы клетки, необходимые для биосинтеза белков и нуклеиновых кислот. Поэтому вирусы осуществляют жизнедеятельность исключительно внутри живых клеток. Хозяевами могут быть отдельные клетки (например, бактерии) или организмы (например, животные или растения). Вирусные частицы (вирионы) многообразны по своей морфологии, но все они обязательно содержат нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), окруженную чехлом из большого числа белковых молекул. У некоторых видов вирусов частицы покрыты дополнительными оболочками, содержащими не только белки, но и липиды. Поверхностные белки вирусов обычно обладают выраженными иммуногенными свойствами, то есть вызывают формирование иммунного ответа в зараженном организме.

При попадании вируса в организм и развитии инфекционного заболевания в иммунной системе индуцируются процессы, направленные на инактивацию свободного вируса и уничтожение зараженных клеток, способных выделять инфекционный вирус. Свободный вирус инактивируется, прежде всего в результате взаимодействия с антителами, специфично связывающимися с поверхностными антигенами вирусных частиц. За выработку антител (иммуноглобулинов) отвечают В-клетки иммунной системы организма (В-лимфоциты). Следует отметить, что в ответ на каждый антиген активируется размножение строго специфичных В-лимфоцитов, которые синтезируют антитела, осуществляющие связывание этого антигена и выведение его из организма. Такой иммунитет часто называют гуморальным. Важнейшим механизмом в уничтожении зараженных вирусом клеток (на поверхности которых представлены некоторые антигены вируса) является активация размножения специфичных Т-лимфоцитов, лизирующих (разрушающих) эти клетки. Данный тип ответа иммунной системы называют клеточным иммунитетом. В результате прошедшей инфекции в организме переболевшего животного сохраняется небольшое количество специфичных (сенсибилизированных) В- и Т-лимфоцитов, которые при повторной инфекции таким же вирусом могут быстро размножаться и обеспечивать устойчивость организма к данному патогену. Такое состояние организма также называют иммунологической памятью.

Первоначальная устойчивость к повторной инфекции обусловлена главным образом воздействием специфичных антител на свободный вирус. С момента начала развития инфекции (заражения клеток и размножения в них вируса) важную роль начинают играть иммунные механизмы, направленные на лизис зараженных клеток и тем самым ограничивающие размножение вируса. Окончанию инфекционного процесса содействуют опять же антитела, действующие на свободный вирус. Приведенное описание очень схематично. До сих пор ни для одного патогенного агента нет четкой ясности относительно вклада разных механизмов иммунитета в устойчивость организма к инфекции. Поэтому эффективность развития иммунного ответа при использовании того или иного подхода определяется только экспериментально, сначала на лабораторных животных и лишь затем на людях. В настоящее время ясно, что для эффективной иммунопрофилактики необходима стимуляция возможно большего числа иммунных механизмов в правильном соотношении.

Иммунный организм или совершенно устойчив к инфицирующему микроорганизму, или обусловливает протекание заболевания в легкой форме. Поэтому большое внимание медицина и ветеринария уделяют разработке методов эффективной и безопасной иммунизации (вакцинации) людей и домашних животных. Существуют разные типы вакцин, каждый из которых имеет определенные достоинства и недостатки.

Живые цельновирионные вакцины могут быть гомологичные из ослабленных вирусов, против которых используются с профилактической целью, и гетерологичные из гетерологичных вирусов. Главным компонентом любой вакцины являются возбудители или их субъединицы.

Противовирусные вакцины должны отвечать следующим требованиям: быть специфичными, т. е. иметь антигенную идентичность с возбудителем болезни; полную общую безвредность; иммунологическую реактогенность; стерильность и иммуногенность.

В качестве живых вирусных вакцин обычно используют так называемые аттенуированные (ослабленные) варианты вирусов, которые являются утратившими большинство свойств патогенности мутантами исходно патогенных штаммов. В редких случаях удается найти близкородственный слабопатогенный вирус, вакцинация которым обеспечивает иммунную защиту от другого опасного вируса (наиболее яркий пример: предложенная Дженнером вакцинация вирусом оспы коров против натуральной оспы).

Получение живых противовирусных вакцин включает получение аттенуированных штаммов вирусов путем:

1) различного рода адаптаций патогенных вирусов к маловосприимчивым или совсем невосприимчивым лабораторным животным; к куриным эмбрионам; к культурам клеток. При аттенуации (ослаблении) вакцинный штамм (в отличие от дикого) размножается в организме ограниченно или вследствие повышенной температурной чувствительности в условиях организма хозяина (ts-мутанты), или вследствие изменения тропизма и утраты способности поражать определенные ткани. Однако оба типа аттенуации ведутся параллельно с отбором модифицированных клонов в лабораторных условиях с помощью специальных приемов. В настоящее время находят все большее применение температурочувствительные вакцинные штаммы в связи со способностью их размножаться только в тканях организма, имеющих подходящую температура; при интраназальном введении их размножение ограничивается верхними дыхательными путями, что обеспечивает надежную защиту животных от респираторных инфекций;

2) селекции природно-ослабленных штаммов вирусов при атипично или латентно протекающих инфекциях;

3) использование гетеротипичных антигенно родственных апатогенных штаммов в качестве живых вакцин.

Живые противовирусные вакцины представляют лиофилизированные взвеси вакцинных штаммов вирусов, выращенных в различных биологических системах (куриных эмбрионах, культурах клеток, организме лабораторных животных). Основное свойство последних, принципиально отличающее их от циркулирующих в природе патогенных штаммов, - стойкая утрата способности вызывать в организме привитого животного типичную инфекционную болезнь. Вместе с тем вакцинные штаммы обладают способностью «приживляться» в организме животного, т. е. размножаться как в месте введения, так и в регионарных лимфатических узлах и внутренних органах.

Пребывание и размножение в организме вакцинного штамма (так называемая вакцинальная инфекция) продолжаются обычно от 5-10 дней до нескольких недель и не сопровождаются клиническими проявлениями, характерными для данной болезни, приводят к формированию иммунитета против инфекционной болезни, и вызываемого патогенными формами соответствующего возбудителя.

Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный иммунный ответ. Кроме того, такие вакцины относительно дешевы, так как для иммунизации требуется небольшая доза вируса, поскольку он размножается в зараженном организме.

Живые вакцины, полученные на основе аттенуированных вакцинных штаммов вирусов, обладают рядом преимуществ перед инактивированными. Главное из них – высокая напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета, приближающегося к постинфекционному. Важное достоинство живых вакцин – возможность для большинства из них однократного введения. Развитие вакцинальной инфекции сопровождается размножением вакцинного штамма в организме, образованием и поступлением в организм в течение длительного времени активных антигенных субстанций, обеспечивающих формирование напряженного иммунитета.

Вторым преимуществом живых вакцин является возможность применять их не только подкожно, но и перорально, интраназально и аэрозольно.

Однако живые вакцины наряду с отмеченными преимуществами имеют и ряд недостатков: они обычно сохраняют некоторый уровень остаточной патогенности, хотя он может быть и очень низким. Одной из проблем при массовом производстве аттенуированных вакцин является их возможная генетическая нестабильность, приводящая к возвращению свойств патогенности. Поэтому партии вакцин необходимо тщательно проверять на лабораторных животных. Кроме того, для живых вакцин серьезной проблемой может быть их биологическая нестабильность при хранении и использовании в практической медицине (или ветеринарии). Более того, как показывает опыт, иногда живые вакцины в процессе наработки на культурах клеток могут загрязняться другими вирусами, поэтому требуется строгий контроль за качеством получаемых препаратов вакцин.

Трудности, возникающие при получении и использовании живых вакцин, удается преодолевать в случае инактивированных вакцин, которые представляют собой препарат патогенного вируса, инактивированного (убитого) формальдегидом, бета-пропиолактоном или каким-либо другим химическим соединением. Инактивация направлена на вирусный геном и по возможности не должна затрагивать белковый каркас вирусной частицы. В данном варианте риск заражения при вакцинации практически отсутствует, не требуется проводить сложную, длительную и не всегда удачно завершающуюся работу по получению аттенуированных штаммов. Инактивированные вакцины, как правило, проще сохранять.

Основным недостатком инактивированных вакцин является то, что они уступают аттенуированным живым вирусам в отношении индукции Т-клеточного иммунитета. Кроме того, для эффективной индукции В-клеточного (гуморального) иммунитета необходимо вводить относительно большие дозы инактивированной вакцины с определенной периодичностью, что может приводить с течением времени к аллергизации организма. При инактивации вируса часть антигенов может полностью или частично разрушаться, что также снижает качество вакцины. Следует отметить, что при препаративной наработке патогенных вирусов, предназначенных для получения инактивированных вакцин, предъявляются повышенные требования по обеспечению безопасности как самого персонала, так и окружающей среды, то есть требуются дорогостоящие, специально оборудованные помещения.

Живые вакцины не содержат консервантов, поэтому при вскрытии ампул и растворении их содержимого необходимо строго соблюдать правила асептики. При накожном методе вакцинации недопустимо использование для предварительной обработки таких дезинфицирующих веществ, как настойка йода, растворы карболовой кислоты и других веществ, которые длительное время могут оставаться в месте применения препарата.

В России в ветеринарной практике живые вакцины используют для профилактики ньюкаслской болезни (из штаммов La Sota, B₁, H, Бор/74/ВГНКИ), болезни Ауески (ВГНКИ, БУК-622), чумы плотоядных (668-КФ, ЭПМ, Рокборн), чумы крупного рогатого скота, инфекционного ларинготрахеита птиц (лиофилизированная вакцина из штамма ВНИИБП), оспы овец (лиофилизированная культуральная вакцина из модифицированного штамма вируса), чумы свиней (лиофилизированная культуральная вакцина из штамма К), болезни Марека (лиофилизированная вакцина из штамма ФС-126), оспы птиц (голубиный вирус оспы), инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (лиофилизированная культуральная вакцина из авирулентных штаммов ТК-А ВИЭВ и Монорин).

2. Назовите методы, с помощью которых можно обнаружить противовирусные антитела в сыворотке и определить их титр.

Антителами называют белки, образующиеся в организме теплокровного животного в ответ на парентеральное введение высокомолекулярных веществ с признаками генетической чужеродности для данного организма. Вещества, на введение которых образуются антитела, называются антигенами. Вирусы в подавляющем большинстве являются антигенами. Антитела способны вступать во взаимодействие с тем антигеном, в ответ на который они образовались (специфичность антител), и нейтрализовать его биологическую активность. Таким образом, антитела защищают организм от инфекционных агентов, и в этом состоит биологический смысл их образования.

Обычно источником антител служит сыворотка крови (serum), и поэтому реакции взаимодействия антител с антигенами in vitro называются серологическими.

Серологическим исследованиям подлежат сыворотки крови больных животных. Обычно используют парные сыворотки, для получения которых от каждого животного кровь берут дважды с интервалом в 2-3 недели. Для получения парных сывороток кровь необходимо брать в начале и в конце болезни, но практически уловить эти сроки удается редко. Брать кровь и получать из нее сыворотки необходимо в асептических условиях, чтобы сыворотки были стерильными. Хранить их до исследования необходимо под пробками в холодильнике или в замороженном (минус 25 ⁰С и ниже) состоянии.

Задача сводится к установлению в парных сыворотках титра антител к вирусам, которые предположительно могли быть возбудителями болезней животных, от которых получены сыворотки. Наличие в сыворотках антител и их титры определяют в серологических реакциях с использованием антигенов предполагаемых вирусов.

Выбор серологической реакции определяется тем, какая из них наиболее пригодна для работы с данным вирусом, а также возможностями лаборатории и квалификацией персонала. Проще всего задача решается, если вирус, к которому ищут в сыворотках антитела, обладает гемагглютинирующими свойствами. В этом случае поиск и титрование антител имеют смысл производить в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) как наиболее простой по технике и быстро дающей ответ.

РТГА (РТЗА) – реакция торможения (задержки) гемагглютинации. Она основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело. Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.

РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток: РТГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах; к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре; ко всем смесям добавляют равные объемы 1 % - ной суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

Простотой техники использования и быстротой отличается также РДП – реакция диффузной преципитации в геле (синонимы: реакция гель-преципитации, реакция двойной диффузии в геле) основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов и отсутствии такой способности у комплекса антиген + антитело. Комплекс антиген + антитело образуется при контакте диффундирующих навстречу друг другу гомологичных антигена и антитела. Он осаждается на месте образования в толще геля в виде полосы преципитации.

Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублений (лунок) и в них наливают антигены и сыворотки так, чтобы антиген и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими антиген и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу (двойная диффузия в геле). Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации, которая хороша заметна на фоне прозрачного геля. Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка будут негомологичны, полосы преципитации не образуется.

Достоинства РДП: простота техники постановки, быстрота получения ответа, нетребовательность к чистоте компонентов, не требуется стерильной работы, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми антигенами, возможность документирования результата путем фотографирования.

Основной недостаток: низкая чувствительность.

В этой реакции затруднительно произвести уверенное титрование антител.

С целью повышения чувствительности РДП ее ставят с положительным контролем, т. е. заведомо положительным антигеном, и результат учитывают по загибам («усам») полос преципитации.

Все это заставляет использовать РДП только в случаях, когда необходимо получить быстрый ответ о наличии антител к неагглютинирующему вирусу и не требуется точное определение титра антител в сыворотках, т.е. только для предварительной ориентировки.

РНГА – реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Сущность реакции в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител). Этот феномен положен в основу метода обнаружения и титрования антител. Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген – антитело и регистрируется визуально по характеру сформированного осадка.

Следует отличать РНГА от РГА. В РГА эритроциты склеиваются (агглютинируются) в результате взаимодействия их рецепторов с рецепторами вирусов, а в РНГА – комплексом антиген + антитело.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи: а) обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные вирусом; б) обнаруживать и идентифицировать вирусный антиген. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные антителами.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность (по этому показателю она превосходит РДП, РСК и близка к иммуноферментному методу), простота техники постановки и быстрота ответа (через 2-3 часа). Однако есть и недостатки. Это трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты компонентов, необходимость подбора режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т.д.).

РСК – реакция связывания комплемента может быть использована для определения титра антител ко многим вирусам, если этап связывания комплемента вести длительно на холоде. Однако РСК требует наличия соответствующим образом подготовленных антигенов, отличается трудоемкостью и требовательностью к точности дозировки компонентов. Тем не менее, РСК широко используется в диагностической работе.

Наиболее достоверные результаты по титрованию антител практически к любым вирусам (кроме бешенства и чумы свиней) дает реакция нейтрализации (РН). Она состоит в том, что в пробирке соединяют равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после выдержки определяют, сохранился ли в смеси активный вирус. Делают это путем заражения смесью, чувствительной к взятому вирусу живой системы (биопроба на тест-объектах). Отсутствие действия вируса на тест-объект (отрицательная биопроба) при положительном контроле расценивается как свидетельство нейтрализации биологической активности вируса антителами сыворотки и, следовательно, гомологичности антител сыворотки и антигенов вируса. При этом чем больше в сыворотке антител к взятому вирусу, тем в более высоком разведении она еще способна нейтрализовать определенную (стандартную) дозу вируса (обычно 100 ЭД₅₀). В случае же положительной биопробы считают, что нейтрализации вируса не произошло, так как сыворотка не содержит антител к взятому вирусу. В зависимости от вида тест-объектов рН может быть поставлена на лабораторных животных, куриных эмбрионах или культурах клеток.

Так как антитела с гомологичными антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях и содержание антител в сыворотке всегда неизвестно, берут не одну, а ряд пробирок, в которых вирус и сыворотка находились бы в разных соотношениях. Для этого или к разным дозам (разведениям) сыворотки добавляют одну и ту же дозу вируса, или к разным дозам (разведениям) вируса добавляют одну и ту же дозу сыворотки.

Достоинства реакции нейтрализации: универсальность и высокая специфичность. Недостатки РН: большая трудоемкость, необходимость строго соблюдать стерильность материалов и инструментов, высокая стоимость живых тест-объектов, необходимость проведения математических расчетов, относительная длительность биопробы.

После установления титра антител в парных сыворотках результаты интерпретируют, исходя из динамики титра. Считается, что нарастание в 4 раза и более титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой уверенно свидетельствует об активном инфекционном процессе, протекающем в организме животного в период взятия у него крови. При этом болезнь была вызвана тем возбудителем, к которому было найдено повышение титра антител в парных сыворотках.

Недостаток метода серологической диагностики – его ретроспективность, так как к моменту постановки диагноза животное, от которого получены парные сыворотки, уже или выздоровело, или пало. Однако поставленный серологическими методами диагноз дает уверенные представления о болезни и имеет важное значение для мероприятий по ликвидации вспышки вирусной болезни или ее эпизоотии.

3. В птицеводческом хозяйстве заболели куры. Заболевание протекало со следующими клиническими признаками: угнетение, отказ от корма, снижение яйценоскости, кашель; затрудненное дыхание, сопровождающееся хрипами. У некоторых птиц слезотечение. Гибель – 2 %.

При вскрытии павших птиц установлено: в просвете гортани и трахеи казеозные пробки, слизистая оболочка трахеи воспалена, гиперемирована, нередко с кровоизлияниями, слизистая оболочка глаз воспалена и отечна.