Контроль за постоянством абиотических факторов при непрерывном куль-ии мк в ферментерах и реакторах.

Большинство ферментеров работают по принципу полного смещения (для создания одинаковых условий во всей среде). Абиотические факторы: 1) Аэрация пит. среды (О2) – для аэробов. В ферментерах в толще среды создается анаэробные условия -> необх. подавать смесь газов (воздух). В обычном МПБ при комнатн. t раст-ся 6-6,5 мл О2,этого вполне достаточно, чтобы мк усвоили 8-8,5 мг (это 1/1000 для углеводов в обычн. пит. сред). Чтобы О2 не был лимитир. фактором, необх. 10-15% О2 от начальной насыщаемости (если принять 6-6,5 мл О2 за 100). Газовая смесь подается под мешалку и разбивается -> увелич.  О2, скорость перемешивания. Датчик растворенного О2 – на прямую измер. кол-во О2. Если нет датчика – ротаметр. 1,5- 2 VО2 через пит. ср. 1 минуту. Это норма подачи О2. Любая газовая смесь должна быть стерильна – через фильтры (сами фильтры стерильны – в автоклаве 100-150С в теч. 2-х часов). В этих ферментерах можно культивировать облигатные анаэробы, для этого: 1) ферментер заполняется мах полностью; 2) исп. только предварит. регенерированную пит. среду (погретую при 85-90С как только остынет до 40С – вносят расплодку); 3) анаэробов вносят до 20% к V пит. ср.; 4) Реакторы кислот, щелочей – хранятся в анаэробных условиях, чтобы не вносить с ними О2. Исп-т вос-ли: аскорбин. к-ту, цистеин, сульфиды, не токсичные для орг-ма тиогликолят – способст. созданию анаэробных условий. Контроль за регулированием рН. рН – соотношение ионов Н+ и ОН-, разные мк требуют разную рН. Большинство мк – нейтральн. рН. У многих бактерий разлаг. мочевину, пат. мк рН= 7,2- 7,8. Мик. бакт., дрожжи, плесени – 6,8-6,6, ацидофильные бактерии рН= 5-5,5 (оч. кисл.). Поддержание оптим. рН важно для тех. мк, кот. продуцируют орг. к-ты, а сами не устойчивы к кислоте. Можно: 1) добавл. кислот или щелочей (бест); 2) забуферная пит. ср.; 3) несбраж. в-ва. Пеногашение – в ферментере автоматич. Постепенно в фер-ре обр-ся много пены (за счет белка и др) – мк, кот. выносятся из пит. среды с потоком воздухаиз ферментера, для этого исп. пеногаш. в-ва – минеральные масла из группы алкенов, они не должны быть токсичны для мк – пропинол или раст. масла. Стерилизация ферментера – снимается со станина и стерилизуется в автоклаве.

Субклеточные (рибосомальные) вакцины.

- это препараты, сост. из рибосом соответств. возбудителя. Они имеют некот. преимущ. перед обычными вакцинами. Открытие иммуноген-сти бак. рибосом в 1965 году. Это послужило толчком для длит. исслед. и разработки вакцин, приминит. к микобакт (сальм., гемофил.. бруцел., лептоспироз и др.). Методы: мех. разрушение - > ультроцентрифугирование -> высаливание. Преимущества: 1) бак рибосомы не обл-т токсичностью для орг-ма и малореактоген; 2) облад. выраж. иммуногенностью по сравнению с корпускулярной вакциной; 3) рибосомн. вакцины способны индуцировать перекрестн. им-т в пределах вида. Механизм действия рибосом не до конца расшифрован. Наиболее приемлемой – образование и совместное действие комплексов РНК и + АГ. Иммулогич. специфичность опред. АГ, а РНК учавствует в предоставлении АГ-на иммунологически компетентным клеткам. В наст. t усиленно разрабатывается, т.к. они наиболее иммуногенны. В медицине такие вакцины уже есть.

Биотехнология (лекции).

Несколько тысячелетий использовались микробные фермы в пивоварении и получения винных напитков, консервирования и хранения пищи. История промышленной м/б и ее современное состояние, определяемое как биотехнология, позволяет проследить тесную связь фундаментальных и прикладных исследований со времен Пастера. Приблизительно столетие назад исследования Пастера были направлены на решение практических задач на причину порчи вина привили к становлению биотехнологии. Доказали гниение и брожение м/о. Были сделаны реальные предпосылки для развития прикладной технолологии м/б, а позже и биотехнологии в современном понимании. Следующий этап: связан с открытием в 1940 году А. Флемингом пенициллина. Это обусловило разработку методических приемов, сыгравших решаущую роль в развитии молекулярной биологии и дало мощный толчок важнейшим изменениям в фармацевтической промышленности, резкому повышению значения технических наук биопромышленности. В середине 60-х годов многие открытия в биохимии, генетике, клеточной и молекулярной биологии произвели революционные изменения в промышленной м/б и дали начало биотехнологии в современном ее понимании как науке. Значительными открытиями являлись определение полной структуры белка интерферона, 2-х нитей ДНК, расшифровка генетического кода и его универсальности для бактерий, растений, животных. В результате генетической информированности, т.е. взаимосвязь между генетическим кодом и структурой белка стали доступны для изучения. В 70-х годах в результате усовершенствования аналитических методов появилась возможность автоматического определения структуры белков, их аминокислотной последовательности, разработать методы и приборы для автоматического химического анализа НК, а следовательно, и генов. Были искусственно синтезированы молекулы биополимеров, гены, гормонов (СТ и инсулин человека). Эти гены были введены в клетку E. сoli и такие E. сoli стали продуцировать гормоны человека. Этим было положено принципиально новой технологии получения рекомбинантной ДНК или генной инженерии ( 70-79 года). Методы генной инженерии открывают дополнительные возможности для уже освоенных биопроцессов (получение штаммов-мутантов суперсинтезом веществ) и дает оригинальный способ получения новых, ранее не доступных веществ, позволяет осуществить новые процессы. Т.о. генную инженерию можно рассмотреть как одну из методов генетики, так и биотехнологических процессов. Появления термина биотехнология связано с возникновением генной инженерии. Большие успехи получены с технологиями ферментов и м/о, биороизводством аминокислот, белка одноклеточных, превращения стероидов, культивирование клеток животных и растений. Во всех случаях эволюция биологии и биотехнологии были неотделимы от главных этапов в развитии знаний об основополагающих механизмов жизнедеятельности. Сейчас разработка и освоение биотехнологических систем занимает важнейшее место в народном хозяйстве и достижения в этой отрасли одна из центральных задач в глобальной экономической политике. Многие страны накопили опыт производства биотехнологической продукции для с/х, пищевой промышленности, фармацевтической и химической медицины, ветеринарии. Отечественная биотехнология – наша промышленность стала производить м/б белок (ежегодно около 1 млн. т. на основе гидролиза древесины и с/х отходов и очищенных парафинов нефти. Ежегодно выпускают  20 тыс. т. лизина, одна тонна экономит 50 т. фуражного зерна). Создана крупная биопромышленость по выпуску антибиотиков, ферментов, инсектицидов, освоено культивирование клеток животных и растений. Важную область медецины и ветеринарии биотехнология состовляет производство вакцин, гормонов, витаминов, биостимуляторов, антибиотиков, пробиотиков, диагностических и лечебных сывороток на бипредприятии.

В научном пути развития битехнологии выделяют 4-е этапа:

1. Битехнология пищевых продуктов, в т.ч. продуктов брожения;

2. битехнология органических кислот, растворителей и получения биомассы нестерильных условиях;

3. битехнологическе процессы в стерильных условиях, включая получение вакцин и антибиотиков;

4. современный этап – применение ферментов и клеток, достижения молекулярной биологии, генной и клеточной инженерии (рекомб. ДНК др.). Развитие новых технических средств в виде биодатчиков, биореакторов, контрольно-измерительная система, техники очистки и концентрации и ЭВМ.

Определение биотехнологии как науки.

До 80-х годов биотехнология определяли терминами промышленной микробиологии: техническая биохимия, технология ферментов, прикладная генетика, биоинженерия и т.д. Новые открытия объединили разрозненные направления. Битехнология стала наукой о практическом использовании биологии в целом, а не отдельных ее ветвей. До последнего времени биотехнология была полем деятельности микробиологов и энзимологов и ее можно было определить как прикладную науку об использовании биологических процессов в технике и промышленности. Если энтерпретировать сущьность биотехнологии применительно к технологии пищевой, мясо- и молокоперерабатывающей промышленности, то больше подходят определение биотехнологии как комплекса знаний о целенаправленном научно-обоснованном использовании биопроцессов, переработки и использования сырья. Применительно к ветеренарной биопромышленности, это конструироание и получение биопрепаратов по определенным техногиям. В 1987 году латышские ученые в книге биотехнологии дали определение: биотехнология – это управляемая получением, полезная для народного хозяйства, медецины, целевых продуктов с помощью биологических агентов ( м/о, вирусы, клетки животных и растений) и с помощью внеклеточных веществ и компонентов клеток. Это не окончательная формулировка понятия биотехнологии как науки правильно определить как науку о закономерностях поведения биологических систем при управляемом, контролируемом получении целевых продуктов и решения народнохозяйственных задач с основных билогических и технических позиций. Из такого определения можно сформулировать теоретические и практические задачи. Теоретичесая задача – это изучение и понимание закономерности поведения и реакции биологических систем в специальных искусственных, создаваемых условиях максимально способствующих проявлению генетических свойств или активности биологического агента, т.е. целевого производственного назначения. Т.к. поведение биосистемы динамично и проявляется в форме последовательности процесса управляемого инженернотехническими средствами и технологическими решениями, то возможно при этом биотехнологический процесс можно признать в качестве предмета или объекта биотехнологии. Биотехнологический процесс складывается из ряда последовательных производственных этапов работы. В любом биопроизводстве следует выдилить основные компоненты биотехнического процесса: 1) биологические агенты (м/о, вирусы, культивированные клетки тканей, внутриклеточные продукты); 2) субстракты (питательные среды, сырье, отходы производства); 3) аппаратура; 4) совокупность методов для управления процессом (технология); 5) конечный целевой продукт.

Они специфичны для каждого производства.

Прикладные задачи: технико-экономическая оценка альтернативного получения продукта. Особенно важна ранняя оценка.

Критерии: 1) продукт производства не может быть получен без биологического агента; 2) стоимость продукта превышает стоимость сырья, что продукт может все окупить; 3) получение продукта б/т путем является единственным экологической альтернативой. Вероятность осуществления б/т процессов не превышает 15-20% (США). Из них 60% достигает завершения, 30% - коммерческое освоение, 12% - прибыльн. оказ.

Б/т связана со многими науками; инженерно-технич., технич.-экономическими, химико-физич. и др.

Битехнические основы селекции производственных штаммов м/о.

1. Особенности строения и финкционирования наследственого аппарата прокариота; 2) модификационная изменчивость м/о; 3) принципы и способы получения мутантных штаммов м/о; 4) принципы и способы получения рекомбинантных штаммов м/о; 5) методы селекции и генная инженерия. Наследственные свойства м/о являются его важным признаком. Биологические предприятия получают штаммы в готовом виде с паспортом. Из-за нарущений операций по применению, сохранениюю ист. возникших отклонений. Отклонения возникают из-за нарушения б/т процесса (неподходящие условия для м/о). Основная часть селекционной работы проводится в научных учереждениях. Успех в б/т промышленности определяется глубокими знаниями законов генетики, строения и функционирования прокариотов. Всякое живое существо сходно с предками. Сохранение специфических свойств в ряду поколений – наследственость. Вся информация о признаках м/о сосредоточена в генетическом аппарате. Генетический аппарат с одной стороны стабилен, а с другой – пластичен. Это важная особенность м/о. До 40-х годов думали немногие, что бактериии обладают наследственностью. Но пришли к выводу, что м/о подчинены общим законам генетики: 1) Носитель информации – ДНК (двойная спираль, замкнутая в кольцо, в структурном отношении соответствует 1 хромосоме). Информационные свойства хромосом определяют специфику наследования четырех нуклеотидов. Хромосома в химическом и функциональном отношении неоднородна. каждый детерменирующий участок называется геном. Гены расположены линейно. Совокупность всех генов клетки – генотип, в котором полностью заложена информация о всех свойствах, присущих клетке. В ряде случаев у м/о есть нехромосомные ДНК, которые сосредоточены в плазмидах. ДНК – полимер, состоящий из однотипных, более простых молекул. В состав ДНК входят: 1) остаток фосфорной кислоты; 2) доиксирибоза; 3) азотистые основания: - пурины (аденин, гуанин); - пиримидины (тимин, цитазан). Их соединение между собой представляет мономер – нуклеотид. Специфика индивидивидуальной ДНК различна в количестве N-ых оснований и их чередовании в дальнейшем по длине полимера. Отношение А к Т и Г к Ц очень близки к 1. Суммарное отношение А+Т/ Г+Ц - широко варьирует взависимости от вида . Макромолекула состоит из двух цепей, наличие А или Г в одной, соответствует наличию Т и Ц в другой. Цепи соединены водородными связями. Когда микробная клетка делится происходит раскручивание ДНК и цепочки расходятся. К ним присоединяются соответствующие остатки. Т.о., сформировывается комплиментарная дочерняя цепь, в следствии этого образуется 2-я спираль. Этот процесс называется реплекацией ДНК. Сама ДНК не служит матрицей. Биосинтез белка происходит на рибосомах. Информацию передает и-РНК. В РНК замена дезоксирибозы на рибозу, а тиамина на урацил. РНК синтезирует на одной из цепей ДНК. При синтезе матричной ДНК копируется информация (транскрипция). репликация ДНК (репликация) м-РНК  (трансляция) белок. Специфическая информация, содержащаяся в гене определяется последовательностью оснований в цепи ДНК. Для перевода на язык аинокислот служит специфический код. Каждые три нуклеотида составляют кадон. Он кодирует одну аминокислоту. В трансляции учавствуют матричная и транспортная ДНК. Присоединение аминокислот к т-РНК осуществляется с помощью ферментов – синтетаз. Рибосома перемещается вдоль м-РНК, следовательно идет синтез белка (наращивание цепи). Механизм трансляции отличается высокой точностью, но ошибки бывают (10^-4). Эти ошибки при трансляции не воспроизводятся, если они не закодированы. Генетический материал, необходимый для жизнедеятельности м/о представлен одной хромосомой. Она гаплоидна. Плазмиды – кольцевые замкнутые молекылы, реплицируются они автономно. О них судят по изменению признаков (устойчивость к лекарственным препаратам, изменения в метаболизме и т.д.).

Модификационная изменчивость м/о.

На организм влияет внешняя среда. Комплекс признаков, проявляющийся у м/о в конкретных условиях существования называется фенотипом. М/о могут иметь несколько фенотипов при одном генотипе. При изменении условий культивирования (в пределах адаптационной способности) - м/о преобретает определенный фенотип. Это выявляется в скорости роста, жизнеспособности. Появившийся новый фенотип вытесняет исходный. Эти различия – результат взаимодействия генотипа и среды. Модификации – внешние различия в пределах штамма. Модификационная изменчивость – смена фенотипов при смене условий существования. Фенотип – совокупность наблюдаемых признаков м/о. Генотип – совокупность наследственных задатков. Адаптация – изменения на уровне фенотипа. Она не затрагивает клеточный генотип. Два типа генов у м/о: 1) структурные – отвечают за синтез специфического белка; 2) регуляторные - отвечают за синтез продуктов белковой или небелковой природы, выполняющие роль регуляторов б/х активных веществ. Структурные – зависят от генотипа и малоизменяемы. Регуляторные – функция смещения под действием внешней среды. Регуляторные гены могут включать и выключать генетический код вплоть до полной остановки. Современная генетика доказала, что наследуются генетические признаки и норма реакции. Фенотипические изменения проявляются у большинства особей. Они наблюдаются только в условиях действующего фактора. Этот процесс управляем. Каждый процесс включает несколько ферментативных реакций, регулируемый на двух уровнях: синтез фермента и изменение его активности. Цель регуляции: обеспечить скорость синтеза определенных белков (ферментов) и синтеза суммарного клеточного белка. Это определяется частотой транскрипции. Многие ферменты образуются непрерывно (конструктивные ферменты). Образование катаболических ферментов регулируется путем индукции через субстрат, имеющийся в среде. Индукция и репрессия действуют медленнее через субстрат. Образование анаболитических ферментов регулируется путем репрессии конечных продуктом, который накапливается. Ферменты, необходимые для синтеза основных компонентов образуются непрерывно. Но, если если появляется избыток продукта, то синтез подавляется.

Понятие о гомологии ДНК как критерии родственности определяемых форм.

А+Т/ Г+Ц у разных м/о от 0,69 до 1,83. У близкородственных м/о это отношение строго определено. Коэффициент соотношения комплементарных оснований сейчас принят в качестве коэффициента видоспецифичности.

Принципы и способы получения мутантных штаммов м/о.

1. мутации и механизм их возникновения; 2 ) спонтанные и индуцированные; 3) фенотипические проявления и оценка мутации; 4) реверсия и ревентарные штаммы. Наследственные признаки с изменением генатипа – наследуются (генатипические изменения, которые проявляются в двух формах: мутациях и рекомбинациях генов). Механизмы возникновения мутаций. Внезапно возникшие и генетипически наследуемые изменения в генетическом аппарате клетки. Доказать скачкообразность изменений очень трудно, т.к. отличить фенотипическую адаптацию от генетической очень сложно. Фенотипическая проявляется у всех особей популяции, а генетическая у отдельных клеток. Такие клетки более устойчивы, жизнедеятельны. Мутации у бактерий носят спонтанный и ненаправленный характер (в естественных условиях). Различают: цитоплазматические мутации, затрагиваюцие внехромосомные детерминанты и хромосомные детерминанты. Хромосомные мутации: 1) изменение числа хромосом – у бактерий нет, т.к. только одна хромосома; 2) изменение числа и последовательности генов – хромосомные перестройки; 3) изменения непосредствено в гене (количественое и качественое изменение в ДНК) – внутригенные мутации. 2. Можно разделить на четыре вида: 1) выпадение участка хромосомы – делятация; 2) удвоение и умножение числа отдельных генов – амплификация; 3) вставка участка хромосомы в другие места – транспозиция; 4) изменение порядка генов в хромосоме – инверсия. В результате хромосомной перестройки увеличивается или уменьшается количество метаболитов и продуктов жизнедеятельности клетки. 3. Мутагенные – изменение последовательности оснований ДНК в пределах одного гена: 1) выпадение или вставка азатистых оснований (нарушение процессов считывания – транскрипции ); 2) транзиция – замена одного пуринового основания на другое (А на Т); 3) трансверция – замена пуринового основания на перимидиновое (Г Т, Ц). Появляется мутантный фенотип м/к с полной или частичной измененной функцей измененного гена. появляются м/к с измененными свойствами. II. Раздница между спонтанными и индуцированными мутациями прежде всего по происхождению. Численная доля мутаций в клеточных популяциях различна для разных признаков и варьирует от 10^-4 до 10^-11. Частоту мутаций можно увеличить - в ответ на воздействие факторов внешней среды – мутагенные факторы, здесь можно говорить об индукции штаммов. Включение аналогов азотистых оснований. Мутагенные факторы: химическое изменение оснований (азотистая кислота, нитриты), физические (ультрафиолетовые лучи, ионизирующее излучение). Всякая мутация – это внешние изменения в генотипе. Она может быть и положительной и отрицательной. Эффект мутирования для нас с экономической точки зрения, например: Снижение вирулентности м/к для него плохо, а с точки зрения получения вакцины – хорошо. Это зависит от направления работы. Мутации реализуютяс по тем же законам, что и другие генетические признаки. Некоторые мутации не проявляются внешне и их проявление зависит от внешней среды. Может изменение функции ферментов, вплоть до ее потери, и если они отвечают за важные функции, то это может привести к гибели. Чтобы мутация проявилась необходимо провести 2-3 цикла размножения м/к, тогда этот признак закрепится. Способность мутантов к реверсии, т.е. к обратному мутированию. При внутригенной супрессии (подавлени) вторая мутация возникает в том же гене, что и первая и приводит к восстановлению функции белка (1000 –2000 ферментов у E. coli.). При внутригенной супрессии вторая мутация может затрагивать второй ген (даже супрессор) и из-за этого активность поврежденного белка восстанавливается не более, чем на 10% и появляются штаммы супрессорные ревертанты. Они обладают пониженой вирулентностью (их используют для приготовления вакцин – против сальмонеллеза). Новый фенотип мутировавшего штамма проявляется только тогда, когда измененный ген начинает функционировать. Методы выявления мутировавшего штамма: Высев большого числа клеток на твердую среду с ингибитором; Применение антибиотиков; Выращивание субстратов, которые лимитируют рост. Рекомбинантные штаммы микроорганизмов. Методы: коньюгация, трансдукция, трансформация. Стабильность генетического аппарата не стабильна и при всей надежности изменения являются его свойствами. Для прокариотов большая склонность к изменению. В результате появляются новые наследственные признаки, генофонд возрастает. Генетическая информация извне не приносится, имеется путь переноса генов. Особый путь переноса генов (горизонтальная передача) между бактерий одного вида и разных видов и возникновение на этой основе новых особей с рекомбинантным генотипом. В результате рекомбинантные изменения потомственные, которые наследуются частично качество родителей. Это осуществляется половым путем. Рекомбинация у м/к осуществляется тремя способами: коньюгация, трансдукция и трансформация. Независимо от этих способов ДНК переносится от бактерии-донора к м/к-реципиенту. После переноса в клетку-реципиента происходит рекомбинация, ДНК донора встраивается в генетический аппарат реципиента и образуется клетка-рекомбинант.

Коньюгация – перенос генетического материала путем прямого контакта между двумя клетками. Из 10^-9 – только 100 клеток обладают способностью этого мутанта. Не все клетки наделены свойствами донора (связано с наличием полового фактора в клетке – фактор F (плодовитости – кольцевая двухцепочечная молекула ДНК - плазмида)). Свойства половой молекулы: 1) ответственная за процесс коньюгации и гены отвечают за половые волоски (F-пили). При коньюгации таких клеток частота переноса F-фактора близка к 100% и клетка-реципиент преобретает качества донора. Плазмиды и F-пили – не являются обязательным компонентом клетки. Большинство плазмид обладают способностью передачи от клетки-донора к реципиенту при коньюгации – коньюгативные плазмиды. Но есть плазмиды, переходят с помощью F-пили, а самостоятельно не передаются – трансмиссивными или неконьюгативными плазмидами. Могут быть свободные или связаннае с ДНК хромосом – плазмида эписома. Коньюгацию часто применяют при конструировании производственных штаммов м/к: 1) увеличение числа генов; 2) увеличение числа копий плазмид на клетку (до 3-х тысяч).

Трансдукция – передача ДНК от кл. донора к реципиенту при участиии бактериолога. Некот. бактерии преоб-ся в бактериофаги, кот. наряду с собствен. ДНК имеют и ДНК бактерий – трансдуцирующие фаги (не сразу вызывают лизис) – умеренные фаги. Они ничем не отличаются от обычных бак. фагов. Различают 2-а типа трансд.: 1) общая неспецифическая; 2) специфическая. При общей тр-ии – во вновь образ. капсиде упаковывается фрагментом ДНК бактерий с неизвестными св-ми. Специф. – захват. опред. участок ДНК бакт. Фрагменты хромосомы ДНК и фрагменты или в целом ДНК плазмид.

Трансформация – гены б. могут перех. из кл. в кл. без всяких контактов и переносчиков. Передача при помощи раствор-й ДНК. Это может быть при самолизисе при t-ых, физ. воздействии. Трансф. может ос-ся хромосомной и плазмидной ДНК. Трансф. только комплиментн. кл-ки способные адсорбировать и перед-ть эту к-у и таких клеток не более 15% в популяции. На это влияет влажность. Проникать в кл-ку может ДНК выдел. из разных участков, но включ. может только с опред. степенью гомологичности. С помощью трансф. можно вводить в геном опред. новые св-ва, так же удалять вредные (синтез ферментов, полисахар., устойчивость). Из 3-х основных процессов наиб. совершенны конъюгация. Эф-ть генетич. рекомбинации сдерживается многими барьерами. Метод получения рекомб. молекул ДНК или генетической генной инженерии – подход на предотвращение сдерживания генетич. рекомбинации.

Методы селекции мк и генная инженерия.

2. Поиск полезных (ценных) штаммов мк, появ. в природе самостоятельно путем естест. отбора. Они более приспособлены, более устойчивы к факторам внешней среды. Пользуются этими методами , когда искомый признак полезен для мк. Создают благоприятн. условия среды для этого мк, а потом естеств. отбор отбирает сам искомый признак: более приспособлен. форма вытесняет менне присп. форму (исходную); Искусственный отбор естеств. возникающих мутаций. Используют, если исходный фактор явл. неблагоприятн. или безразличным для мк, поэтому создать условия невозможно. Проводят планирование популяций, изучают отдельные клоны (культура из 1-й кл-ки генетич. однородна). Изолируют колонии на плотных питат. средах. Эффективна, если популяция гетерогенны (неоднородна). 2) Искусств. отбор с использованием мутагенных факторов. Мутагены – в-ва, увелич. частоту мутаций. Мутации направлены всеобразно (и + и -). Изменяем данный признак и подходящие варианты. Частота спонтанных мутаций 10^-6 10^-3, потом используют селективные среды. 3) Ступенчатая селекция с использованием мутагенов (селекция а/б) используя веерообразные мутации. Использование на различных мутагенов. 4) Селекция бакт. клеток путем получения ген. рекомбинаций (конъюгация, трансформ., трансдукц.). Следующие методы возникли в конце 70-х г. 5) Генная инженерия, работа с рекомбинантной ДНК. Возможна рекомб. только среди близкородств. мк. Это было раньше. Генная инженерия переносит ДНК в пределах всего живого, никаких барьеров нет. Все живое на молек. уровне устроено универсально: носитель наследственности – нукл. к-та - генетич. код – триплет, переносчик энергии – АТФ. Синтез макромолек. кл-к подчиняется 1-й закономерн.: для репликации, транскрипции., трансляции важным яв-ся послед-сть нуклеотидов в начале и оконч. процесса – сайт.

Схема генной инженерии.

1) получение фрагмента ДНК, кодир. необх. признаки (ген ДНК); 2) получение in vitro рекомб. молекулы ДНК из фрагментов ДНК, полученных на 1-м этапе и векторных молекул ДНК. Векторн. молекулы ДНК – это неh молекулы ДНК, способные самост. реплицироваться в кл-ке – реципиетны (плазмиды или фаговые ДНК). В рез-те объединения получ. рекомбинанты ДНК; 3) введение рекомб. ДНК в кл-реципиент; 4) клонирование.

Этапы работы: 1) источники и способы получения ДНК для клонирования: а – природная ДНК (нужный фрагмент ДНК – прямой источник); б – обратная транскрипция матричной РНК – пользуются, когда необходимо из эукариот в кл-ку прокариота внести информацию. Ген разделен на экзоны (кот. кодируют послед-сть амк), но они чередуются с некодир. областями - интронами (их роль неясна - у незрелой м-РНК). ДНК получают из РНК. Зрелая м-РНК без интронов идет на рибосомы. Синтезируется м-РНК (незрелая). Далее, когда интроны ликвидируют из м-РНК она станов. зрелой и способной к переносу инфекции; в - химико-ферментативный синтезом получ. ДНК. Расшифр. пос-сти амк или нуклеотид. посвлед. гена.; 2) получение рекомбин. ДНК in vitro (способы конструирования) – ДНК мк замкнутая кольцевая структураю ЕЕ необходимо разомкнуть, ее разрезают ферментом рестриктазой, кот. специфич. узнает нужные фрагменты. Более 500 различных рестриктаз. Липкое окончание, однонитьевое. Образование водородных связей через фосфатидные группы – отжит I этап – лигилирование - II (ДНК-лигаза). Самостоят. сборка на I этапе, выход рекомб. ДНК не очень большой. Исп. несколько рестриктаз, вероятность резко повыш., что нужный фрагмент останется. Самосборка только при наличие фосфатных групп. У векторных молекул фосфатные группы щелочной фосфатазой, чтобы она не самосоединялась; 3) введение рекомб. ДНК в кл-реципиент – плазмиды вводят трансформацией, кл-реципиенты поглощают свободую ДНК, поглощают 1 из 1000- 10000 рекомбинантн. ДНК. Фаговая ДНК вводится трансдукцией 1 из 10 рекомбинантных ДНК.; 4) Селекция клонирования – работа гена в чужой клетке называется экспрессия чужеродной генетической информации (///// - 1 \\\\\\ - 2 _______-3 - ген). 1 – сайт-промотор (сайт начала синтеза м-РНК) – с начала транскрипции узнает РНК-полимеразы, расплетает двойную цепь ДНК и начинает синтез матричной РНК.; 2- сайт – SD области – распознается рибосомами и начин. синтез белка; 3 – сайт терминатор (окончание процесса). У близкородствен. мк первые 2-а сайта близки и узнаются ферментами. Сайты яв-ся таксономическими барьерами. Вставляемый генг должен размещаться за промотором (т.е. синтез белка часто или постоянно). Слабые промоторы редко синтезируют белок. I. Возможно вставлять ген в среднюю часть, главное не нарушить рамку счатывания, нужно разрезать между триплетами, белок получается нечистым (р+д+р). Необходимо также чистый, негибридный белок, что не свегда получается; II. Получение гибридного SD-сайта: из SD-сайтов донора и рецептора. В каждом случае этот гибридный участок конструируется снова. Гибридный сайт трудно конструировать (SDр+SDд). Ген со своим терминатором получ. чистый белок. ; III. В ряде случаев терминатор одного гена яв-ся промотором для след. за ним гена. У гена, кот. переносят собственый промотор ликвидируется, а SD-обл. пееркрыв. на 1 нуклеотид с терминатором, т.е. вклинивается за терминатором. При создании промышленных штаммов мк добиваются не max экспрессии, а оптимизации процесса. Например, синтез а/б или органич. к-т – эти в-ва явл. ядовитыми для самой клетки. В таком случае прибегают к использованию регулируемых промоторов (t, pH). Накопили биомассу, включили промотор, накопили желаемое в-ва.