Контроль за постоянством абиотических факторов при непрерывном куль-ии мк в ферментерах и реакторах.

Большинство ферментеров работают по принципу полного смещения (для создания одинаковых условий во всей среде). Абиотические факторы: 1) Аэрация пит. среды (О2) – для аэробов. В ферментерах в толще среды создается анаэробные условия -> необх. подавать смесь газов (воздух). В обычном МПБ при комнатн. tраст-ся 6-6,5 мл О2,этого вполне достаточно, чтобы мк усвоили 8-8,5 мг (это 1/1000 для углеводов в обычн. пит. сред). Чтобы О2 не был лимитир. фактором, необх. 10-15% О2 от начальной насыщаемости (если принять 6-6,5 мл О2 за 100). Газовая смесь подается под мешалку и разбивается -> увелич.О2, скорость перемешивания. Датчик растворенного О2 – на прямую измер. кол-во О2. Если нет датчика – ротаметр. 1,5- 2VО2 через пит. ср. 1 минуту. Это норма подачи О2. Любая газовая смесь должна быть стерильна – через фильтры (сами фильтры стерильны – в автоклаве 100-150С в теч. 2-х часов). В этих ферментерах можно культивировать облигатные анаэробы, для этого: 1) ферментер заполняется мах полностью; 2) исп. только предварит. регенерированную пит. среду (погретую при 85-90С как только остынет до 40С – вносят расплодку); 3) анаэробов вносят до 20% кVпит. ср.; 4) Реакторы кислот, щелочей – хранятся в анаэробных условиях, чтобы не вносить с ними О2. Исп-т вос-ли: аскорбин. к-ту, цистеин, сульфиды, не токсичные для орг-ма тиогликолят – способст. созданию анаэробных условий.Контроль за регулированием рН. рН – соотношение ионов Н+ и ОН-, разные мк требуют разную рН. Большинство мк – нейтральн. рН. У многих бактерий разлаг. мочевину, пат. мк рН= 7,2- 7,8. Мик. бакт., дрожжи, плесени – 6,8-6,6, ацидофильные бактерии рН= 5-5,5 (оч. кисл.). Поддержание оптим. рН важно для тех. мк, кот. продуцируют орг. к-ты, а сами не устойчивы к кислоте. Можно: 1) добавл. кислот или щелочей (бест); 2) забуферная пит. ср.; 3) несбраж. в-ва. Пеногашение – в ферментере автоматич. Постепенно в фер-ре обр-ся много пены (за счет белка и др) – мк, кот. выносятся из пит. среды с потоком воздухаиз ферментера, для этого исп. пеногаш. в-ва – минеральные масла из группы алкенов, они не должны быть токсичны для мк – пропинол или раст. масла. Стерилизация ферментера – снимается со станина и стерилизуется в автоклаве.

Методы контроля ветеринарных билогических препаратов.

Государственный надзор и контроль за производством и качест­вом биологических препаратов для ветеринарии и животноводства, из­готовляемых на предприятиях биопромышленности MСX РФ, других ве­домств и министерств (в том числе поступающих из-за рубежа), осу-тся Всероссийским Государственным научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ). В задачу такого надзора и контроля входят: 1) государственный учет имеющееся в системе МСХ PФ, а также пос­тупающих из-за рубежа и высылаемых в зарубежные страны культур микроорганизмов, токсинов и ядов животного и растительного проис­хождения; 2) хранение и поддержание национального фонда высокоценных штам­мов культур микроорганизмов, используемых для производства препа­ратов и научно-исследовательских целей; 3) проведение экспертизы новых фармакологических препаратов и различиях веществ, предлагаемых для ветеринарных и животноводчес­ких целей научными учреждениями России и зарубежными фирмами. В настоящее время все препараты, применяемые в животноводстсве и ветеринарии, систематически подвергаются государственному контролю, осуществляемому государственными контролерами ВГНКИ, работа­ющими непосредственно на биопредприятиях. С этой целью на каждом биопредприятии создаются контрольные лаборатории во главве с госу­дарственным контролером (заведующим отделом биологического контро­ля при биопредприятии). Государственные контролеры на биопредприятиях являются штатными сотрудниками ВГНКИ. Они обязаны осуществлять контроль за технологией изготовления препаратов и за качеством готовой продукции в соответствии с требованиями нормативно-технической документации (НТД). Государственные контролеры имеют право полностью или частично приостанавливать производство и выпуск биопрепаратов в тех случаях, когда нпрусаотся требования нормативно-технической документации и не принимается меры для устранения причин изготосления недоброкаче­ственно продукции. На кажды йпрепарат, выпускаемый биопредприятием, должна иметься НТД, в кот. входят: 1) инструкция по изгготовлению и контролю препарата, утв. разработчиком данного препарата, содержащая: общие сведения о препарате и его назначении; характеристику производственных штам­мов микроорганизмов и порядок работы с ними при изготовлении пре­парата; подробное изложение технологического процесса производст­ва препарата; методы контроля готового изделия;, условия хранения препарата; правила по соблюдению санитарного режима и мер безопас­ности при изготовлении и контроле препарата;2) технические условия, утверждаемые Департаментом ветерина­рии МСХ РФ и регистрируемые в Государственном комитете стандартов, включающие: технические требования к препарату; правила приемки его Госконтролером предприятия-изготовителя {методы испнтаний пре­парата на его соответствие требованиям НГД с указанием ГОСТов и ТУ на используемые при этом оборудование, материалы, реактивы, а также порядок транспортировки и хранения; перечень гарантий, кото­рые должны обеспечиваться предприятием-изготовителем; 3) наставление по применению препарата, утверждаемое Департа­ментом ветеринарии МСХ РФ, в котором содержатся: общие сведения о препарате (внешний вид, назначение, срок годности, правила хране­ния); сведения о его фармакологических свойствах, подробное изло­жение порядка его применения. Осуществляя свои контрольные функции, государственнне контро­леры обязаны руководствоваться требованиями НТД. Выпуск препаратов с биопредприятий .в ветеринарную практику допускается лишь при ус­ловии прохождения ими следующих контролей: контроль безвредности, микробиологический контроль, контроль специфической активности.

Контроль безвредности биопрепаратов проводят на ларбораторнта или сельснохозяйственнмх животных. Для живых инактивированных вакцин, лечебно-профилактических сывороток и иммуноглобу.пинов этот показатель определяют на основании данных о выживании или гибели прививаемых животных, клинических признаков их переболенания, из­менений массы животных и бактериологических показателен с иденти­фикацией выделяемой от них микрофлоры. При решении вопроса о безвредности препарата следует учиты­вать, что поствакцинальные осложнения могут быть обусловлены рядом причин: прямым к опосредованным токсическим эффектом, который уста­навливают методами фармакологичесшгх исследований, определяя степень изменения физиологического состояния животных; недостаточной аттенуацией культуры вакпионного штамма или неполной инактивацией производственных культур, которые определятют в опытах на животных, чувствительных к данной инфекции; специфической и неспецифической сенсибилизацией, в том числе гиперчувствительностью замедленного типа. Для определения безвредности вакцины или сыворотки вводят жи­вотным" парентерально. Дозы препарата, применяемые при проверке на с/х животных, должны превышать рекомендуемые для практического использования в 2-10 раз; а при проверке на лаборатор­ных животных - приближаться к максимально переносимым. Срок наблю­дения за животными, в течение которого они должны остаться здоровы­ми, не менее 10 дней. Кроме того, контроль безвредности лечебно-профилактических сывороток включает проверку их апирогенности. Апирогенность проверяют на 3-х кроликах породы шиншилла массой 1,5-2,0 кг. Перед опытом кроликов в течение 3-х дней взвешивают и измеряют температуру их тела, которая должна быть в пределах 38,6-39,8 °С. Кроликов, имеющих тен­денцию к снижению массы тела и повышению температуры тела, в опыт не берут. Испытуемый препарат перед введением подогревают до 37 °С и вво­дят кроликам в ушную вену в количестве I мл/кг массы. Через I, 2 и 3 ч после введения препарата у кроликов измеряют температуру тела. Она не должна повышаться более, чем на 0,8 °С. Контроль безвредности антибиотиков обусловлен тем, что при антибиотикотерапии возможны осложнения, в виде прямых токсических реакций и непрямых побочных реакций. Прямых побочные реакции - обусловлены органотропностыо и специ­фичностью эффекта, зависят от дозы, метода и длительности применения антибиотиков. Могут проявляться поражением почек, печени, нервной и кроветворной систем, нарушением деятельности велудочно-кишечного тракта.

Непрямые побочные реакции неспецифичны для антибиотиков и могут быть вызвали веществами различной природы. К такого рода осложнениям относятся; гиперчувствительность, реакция бактериолиза (освобожде­ние большого количества эндотоксинов при гибели и разрушении микроорганизмов), дисбактериоз (качественные и количественные изменения нормальной микрофлоры желудочно-кишечного траста) и др. Исходя из вышеизложенного, антибиотики контролируют в отноше­нии острой и хронической токсичности. Для контроля острой токсичнос­ти определяют: максимально переносимую дояу (МПД) препарата, дозу, рнзнвающую гибель 50% подопытних животных (LД5о), дозу, вызывающую гибель 100% подопытных животных (LD 100). Для контроля хронической токсичности изучают влияние препарата на различные органы и системы организма подопытных животных при его длительном применении. Микробиологический контроль. В жиоых бактерийных и вирусуых вакцинах не должно содержаться посторонней микрофлоры (контаминан-тов); инактивированные вакцины, анатоксины, лечебно-профилактичес­кие сыворотки и иммуноглобулины должны быть стерильными (свободны­ми от жизнеспособной микрофлоры). Чистоту живых и стерильность инактивированных вакцин, сыворо­точных препаратов и анатоксинов проверяют высевами на специальные питательные среды. Для отого.применяют МПА, МПБ с глюкозой; буль­он и агар Мартена; МППБ под маслом; бульон и агар Сабуро или Чапека и другие среды, обеспечивающие рост как анаэробных, так и аэробных бактерий и грибов. Посевы выдерживают при температуре 36-37 °С. Из флаконов с по­севами инактивированных вакцин» анатоксинов, сывороточных препара­тов там, где нет роста, через 5-6 дней делают пересевы на аналогич­ные среды. Первичные посевы выдерживают при указанной температуре 15 дней. Среды Сибуро или Чапека для выявления грибковой микрофло­ры выдерживают 15 дней -при комнатной температуре (20-25 °С). Пере­севы выдерживают не менее 10-ти дней. Для выяснения стерильности антибиотиков используют, как прави­ло, два метода. Первый метод связан с инактиваиией антибиотика биологическим инактиватором (например инактивация бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на его основе, ферментом пенициллиназой) и последующим высовом на питательные среды. При втором методе раствор антибиотиков пропускают через мембранные филь­тры с диаметром пор не более 0,75 мкм. После атого фильтры перено­сят на плотные или жидкие питательные среды. Вторым методом пользу­ются в тех случаях, когда для антибиотика не имеется биологическж инактиваторов его активности.

Контроль специфической активности. Нммуногенную специфическую активность вакцин и анатоксинов оценивают в опытах прямого заражения иммунизированных животных пли косвенными методами. Контроль иммуногенности в. опытах пряного заражении возможен в двух различных вариантах. При порвом иммуногенность оценивают пос­ле однократного (или двукратного) введения препарата не менее чем 10-ти подопытным животным. В контроле должно быть также 10 живот­ных, равноценных подопытным по степени чувствительности к заболева­нию. Всех животных через определенный срок после вакцинации (14-21 день) заражают соответствующей культурой контрольного вирулентного штамма в количестве 5-10 (а в ряде случаев 100-200) ЛД50 или ИД50. Вакцину считают иммуногенной при выживании без признаков за­болевания не менее 8 вакцинированных и гибели или заболевании не менее 8 контрольных животных. Допускается заболевание 3 вакциниро­ванных животных при 100%-ной гибели (заболевании) контрольных. Второй вариант контроля иммуногенности вакцин и анатоксинов заключается в определении ЛД50 или ИД50 контрольного вирулентного штамма для вакцинировали и кнтактных (контрольных) животных. Многократное (в 5-10 и более раз) увеличение величины ЛД50(ИД50) для привитых животных по сравнению с контрольными свидетельствует об иммуногенности препарата. Косвенными показателями иммунологической специфической актив­ности биопрепаратов могут быть алнтигенность, характеризующая уро­вень образования специфических антител в крови вакцинированных жи­вотных, и концентрация антигенов в прививочной дозе. Специфическую активность сывороточных лечебно-профилактичес­ких и диагностических препаратов определяют путем измерения эффекта, присущего препарату данного вида. Так, лечебно-профилактические сыворотки проверяют на превен­тивные свойства на восприимчивых крупных и лабораторных животных. Для этого сыворотку вводят животным внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. Через 24 ч после инъекции сыворотки животкых заража­ют подтитрованной дозой контрольного вирулентного штамма соответст­вующего микроорганизма. Подопытные животные должны оставаться здо­ровыми минимум 14 дней при гибели или переболевании контрольных. Кроме того, контроль специфической активности лечебно-профилак­тических сывороток мокет быть основан на определении концентрации специфических антител в опытах нейтрализации этими сыворотками со­ответствующих инфекционных агентов кли их токсинов. Чем меньше до­за сыворотки, способная нейтрализовать действие определенной дозы инфекционного агента или токсина, тем выше ее активность. Диагностические сывороточные препарата проверяют в соответстующих реакциях (РА, РН, РДП, РТГЛ, РНГЛ, РСК и др.). Активность сывороточных препаратов любого типа определяют по сравненшэ со стандартными (эталонными) референс-препаратами. Для этого испытуемую сыворотку проверяют параллельно со стандартной, а затем рассчитывают дозу испытуемой сыворотки, эквивалентную по эффекту единице активности стандарта. На каждую проверенную серию биопрепарата заполняют паспорт, п котором укалывают основные технологические, лечебно-проклэктичоские и другие специфические показатели: номер серии; дату изготовле­ния; объем серии (в литрах, дозах); объем препарата в расфасовоч­ных емкостях; результаты, полученные при проховденни препаратом контролей; метод и сроки хранения. На каждой серии биопрепарата, признанной пригодной для исполь­зования в животноводстве и ветеринарии, на предприятии-изготовите­ле оставляют арбитражные образцы, которце должны сохраняться в ус­ловиях, определенных требованиями НТД, в течение всего срока годно­сти данной серии препарата.