Анатоксины

Анатоксины - препараты, содержащие инактивированный токсин, вырабатываемый микробом. (Токсины - экзо- и эндо. Эти препараты обеспечивают выработку иммунитета к токсину соответствующего возбудителя. Используются вместе с адъювантом. Примеры: Дифтерийный (АД), Столбнячный (АС), тетраанатоксин (токсины возб газ гангрены), Стафилококковый, Комбинированные препараты: а)дифтерийно-столбнячный (АДС) б) коклюшно-дифтерийно-столбнячный (АКДС)

Приготовление(выделение + адъювант). Токсины получают путем фильтрования жидкой питательной среды или исследуемого материала. где размножались токсигенные бактерии. Анатоксны получают путем обработки токсинов формалином (0,3% р-р) при температуре 37-39⁰С в течение 30 дней. При этом токсин теряет токсические свойства, но сохраняет антигенные. Эндотоксины Е.coli выделяли 3 методами: безводным фенолом, охлажденным бутанолом, их смесью.  Адъюванты (adjuvans помогающий, поддерж) – компонент иммунизируемого препарата, необходимый: 1)для более длит сохр в организме в месте введения; 2)для повышения иммуногенности, допустим, гаптена (полиионы) 3)Адъювант может быть с иммуностимулятором (БЦЖ, тималином)

Ассоциированные вакцины

Для одновременной выработки иммунитета против нескольких инфекций с целью сокращения числа прививок в последние годы применяют так называемые ассоциированные вакцины, в состав которых входит несколько моновакцин. Примером ассоциированных вакцин, использующихся в настоящее время, в настоящее время для иммунизации детей являются широко применяемая во всем мире АКДС-вакцина, а также паратитно-коревая и краснушно-паротитно-коревая вакцины, применяемые в ряде зарубежных стран.

ДНК-вакцины (плазмидные) стимулир клет иммунитет(но не гуморальный.При введении некоторых ДНК-вакцин в организм не экспрессировался закодированный в ДНК белок и не синтезировались АТ. Одновременно с этим имела место индукция весьма выраженного клеточного иммунитета.

Понятия о провоизводственных и контрольный штаммах.

1. 1)произ-е штаммы – использ для приготовл препаратов (источн иммунного начала, 2) контрольные шт – для контроля иммуногенности (для прямого заражения лаб жив). Один штамм может быть и 1 и 2 (кромк произ-ва жив вакц)Требования предъявл к штаммам при изготовлении жив вакцин.1)Должны относиться к слабо- или авирул шт. 2)Должны обладать АГ актив и иммуногенностью. Критерий иммуногенности: При 1 крат введении этих штаммов стойкий иммунитет должен образовываться не менее чем у 70%. 3)Способность разм-ся в опр органах и ткан. 4)Генетическая стабильность фенотип св-в (низк вирул, Агенность и имм-генности, даже при быстро след друг за другом пассажах на естест воспр животных), 5)Наличие генетич маркеров, позв отличать вакцинные шт от эпизоотических. 6)Отсутствие инфекционности в случае выделения штамма из орг жив, безвред для других видов жив. 7)Стабильность при хранении и широта в дозировании. Для вирусов: должен быть опр титр активности.

Принципы аттенуации бакт и вир.

Для изг жив вакц использ аттенуир штаммы (искуств стойкое снижение свойств). Принципы: 1)Длит культивир вирулентных штаммов в неблагопр усл (к мут). 2)Многократный пассаж вир штаммов на животных, не явл есть хозяевами (вначале устойчивы). Аттенуир штаммы полученные путем возд-я на м/о физ. хим.- сибиро-язвен шт. вирусы: шт уличн бешенства, болезнь Нью-Касла, вирус чумы свиней – на кроликах – повысилась вирулен-ть. Др способы: воздейст а/б, лучист энергии и др мутаген факторов. Возможна естествен аттенуация. Вакцины более иммуногенны(способны к реверсии в исход состояние).

Требования предъявл к штаммам при изготовл инактив вакцин. Биотех инактивиров корпускулярн вакцин. В качестве АГ сод-ся целые вирусн частицы. Требования: 1)д.б. опред рода и вида.2)строго очерченный круг св-в.3)сохранять высок вирулен-ть, когда опред на естеств и лаб жив-х. Вирулен-ть LD₅₀, ID₅₀(жив-е болеют), ТЦД₅₀ – титр цитопатического действия (для вирусов).4)высокие иммуноген св-ва (убитая культ должна вызывать иммунитет не менее, чем у 70% жив-х).Инактивир вакцины в зависимости от методов могут носить разные названия (гретые шт +50-60⁰С, под воздействием формалина (0,2-0,3%) сочетают тепло+формалин- 28-30 сут. В термостате37-40⁰С – полная инактивация токсина.

Биотех химич вакцин. Иммунопрепараты, кот готовят из х из микробн молекул АГ, извлеч-х из микробн клетки тем или иным способом (хим способ, ультразвук). Менее иммуногенны.У возбуд-ля выделяют протективные АГ. Эти структуры и применяют. Снижена опасность поствакц-х осложнений. Более стандартны. Имеется возможность концентр АГ в растворе. Адьюванты- в-ва, вызывающие дополн неспециф иммун ответ. Эти вакцины ассоциированы. Протективные АГ- это те структурн элементы, кот обеспеч-т пат-ть м/о.Макромолекулы-

гликопротеиды, белк-полисахар-липидн комплексы (высок иммун-ть), гаптены- низкомолек в-ва, сами не способны вызывать иммун ответ. Гл принципом получения АГ явл-ся применение щадящих методов получения, возможно меньшее число этапов при извлечении этих АГ.

Вакц искусственных АГ, субклет (рибосомальн) вакцины.

Вакцины искусст АГ. Предусматривают синтез аналогов природн АГ, ответствен за образование специф иммунитета против того или иного возб-ля. 3 звена: 1)выделение биологич активн АГ в чистом виде, 2)расшифровка его молекул структуры, 3)искусств синтез (хим путь или генно-инженерный). Препараты из искусств ионизированных молекул являются аналогами природных. Коньюгир АГ- гаптены- на кот нельзя получить полный иммун ответ. Синтет белки, синтетич полиаминокислотн АГ(состоят из полипептидов. Препараты из молекул, не имеющих аналогов в природе. Это искуствен комплексы с синтетич молекулами – полностью синтетич препарат. Поливинилпиридин – усиливает ф-цию Т-хелперов, кооперируя Т и В-лимф,  число плазмат клеток. Носитель обладает иммуномодулир действием. Против дифтер токсина, гепатита В, вируса ящура.

Субклеточн вакцины. Состоят из рибосом соответ возб-ля. Эти вакцины не обладают токсичн-тью, безвредны, выражен иммуноген-ть, способны индуцировать перек иммунитет к разным серогруппам в пределах одного вида возб-ля. Конкурентное действие рибосом. Рибосомальная вакцина - рибосомальная фракция микробов, включающая антигены. Препарат рибомунил (мукозальная вакцина) включает рибосомальную фракцию из культур Diplococcus pneumoniae, Str. Pyogenes и др. Рибосомальная вакцина - микробная вакцина; у одних микробов (шигелл) основную иммуностимулирующую (антигенную) роль играют белковые компоненты, у других микробов - РНК.

30 лет назад открыли иммуностимулирующие свойства рибосомальной вакцины - рибосомы выступают в качестве адъювантов. Это естественная комплексная (случайный комплекс с другими мембранными структурами, на которых есть АГ) вакцина.

Субъединичные вакцины. Генно-инженерные вакцины.

Состоят из фракций цельных убитых микробов (ЛПС, токсинов и др.) Достоинства: наименее реактогенны, моновалентны.

Аллерговакцины - конъюгат аллергена и полиэлектролита (полиоксидония) аллергенную активн, что способствует индукции "блокирующих" Ig G-антител. Недостатки: наименее иммуногенны; используются с адъювантами, необходимость дробного введения. Более иммуногенными следует считать вакцины субъединчиные из белков микроорганизмов, полученных с помощью генной инженерии и синтетические пептидные вакцины.

Субъед вакцины. Улучшение вирусн вакцин. Выделяют, очищают, консервируют. Извлечение и очистка субъединиц вируса. О, Н-антигены. Против стрептококка, пневмонии, колибактериоза

Генноинженерные (рекомбинантные) вакцины созданы на основе картирования геномов микробов. Гены, контролир нужные антигенные детерминанты, переносят в геном других микробов и клонируют в них, добиваясь экспрессии генов в новых условиях. Рекомбин вакцины - микроносители + белковый антиген + адъювант (холерный токсин и пр.). В качестве векторов в живых рекомбин вакц использ малопатоген сальмонеллы, аденовирусы, полиовирусы, вирус Vaccinia. Такие вакцины вызывали развитие как местн, так и системн иммунитета, характеристика которого зависела от использованного вектора.Напр, вирус Vaccinia c протективным белком G вируса бешенства размнож в кишечнике и вызывает местн и систем иммун ответ; аденовирус c протектив белком G вируса бешенства лучше размнож-ся в легких (аэрозольное введение).Малопатог Salmonella typhimurium исп-т в качестве бактериа вектора как носителя поверхностн белка Лейшманий, а также белка С тетанотоксина.

Генно-инж вакцины. Гены кодируют образ-е возб протект АГ. Встройка генов в др биолог объекты. Получение рекомбин клеточ структур, в качестве биолог структур – бактерии, дрожжи, вирусы, кл-ки жив-х. Рекомбин кл-ки могут култ-ть в сис-х, продуцировать АГ возбудителя. Рекомбин вирусы исполь-ся как вакцин препараты(комбинир иммунитет). Вакцины против гриппа, герпеса, ящура. Вакцина против лейкоза.

Системы очистки сточн вод. Аэробный способ:1)фильтрация перкумец стоков. Бактерии находятся в неподвижном состоянии св слиз пленке (р.zooglea, protozoa, нитчатые, сине-зел водоросли). 2)биолог пруды. Строят пруды-отстойники глубиной от 60 до 120см. Развиваются водоросли, одноклет бактерии р.Zooglea, нитчатые. М/о свободно перемещаются в толще воды, кислород свободно поступает через границу воздух-вода. Ил, кот образ в прудах, выводят в лес или получают СН_4.3)процессы идут в ферментерах, в них подаются сточн воды, перемешивают, аэрируют. Процесс носит непрерывн хар-р. Используют для локальной очистки стоков на предприятиях, не требует больших площадей. Анаэробный способ: облигатно аэробные метанообр бактерии. Бактерии, осущ гидролиз и сбраживание орг в-в, бакт, образующ водород и уксусн к-ту, водородотропные метанобр бактерии. Конечн продукты: СН₄, СО₂.1фаза (участв целюлозолит бактерии - бактероиды протеолит орг, Zooglea, бактероиды клостридия, эубакт кол-во в эту фазу – 10⁵-10⁶ кл/мл) – 75% отходовВЖК, 20%укс к-та,4-5%Н₂ 2фаза (участв цитофобакт)-ВЖК: 50%укс к-та, 20%Н₂ 3фаза-(метанообр бактерии 30 видов) метановое брожение укс к-та 70-75% метана, из водорода – 20-25%метана. рН 7-8, t35-40⁰С, процесс идет менее интенсивно, но сист более устойчива. При 50-60⁰С – более инт процесс, но сист часто вых из строя.

Понятие об антибиотиках. Селекция их продуцентов.

Антагонистич отнош между орг. 3 вида антагонизма: 1)с исполз м/о одних и тех же пит в-в. Преимущ получают те м/о скорость роста которых была выше (E.coli, Pseudomonas, Актиномицеты) 2)микробные метаболиты – орг к-ты, спирты, перекисные соед. У м/о которые их синтезир, развилась способность переносить повыш концентр этих в-в. 3)антагон обусл образованием антибиотических веществ (АТБ). АТБ имеют 2 отличия: 1)оказ бактериостат и бактерицид эффект в очень мал концентр (пениц –10^-7 г/мл спирта), 2)избират действие. АТБ-конечн продукт метабол-ма м/о. Способность синт АТБ-специфич особенность конкр штамма или вида м/о.

Селекция продуцентов АТБ. Метод сел- ступенчатый отбор с использ мутагенных факторов. В синт АТБ участв 15-30 генов. Трудно обнар спонтанные мутации, которые вели бы к увел продуктивности АТБ. (исх штамм гриба – продуктив 20 мг/л пит средырентген облуч300мг/л – получ пеницилл). Комбинир воздействие: УФЛ + этиленимин. (исх-250,УФЛ-3000 ЕД/лЭтиленимин 15000-20000 ЕД – получение продуцента стрептомицина).

Единицы биоактивности АТБ, антибиотическая продуктивность орг-ма. ЕД/мг – усл ед АБ содерж о 1 мл р-ра или 1 мг препарата

За 1 ЕД АТБ активности принимают мин кол-во АТБ, способн подавить развитие опр числа клеток стандарт штамма тест микроба в ед пит среды (пениц – золот стафил). Если менять условия культивир м/о то можно наблюдать 3 вар изменений: 1)АБ выхода без биомассы – благо, 2)выход не, а биомасса, - плохо. 3) биомассы и АБ выхода. АБ продуктивность м/о – кол-во АБ в мкг или в ЕД, образуемое 1 мг сухих клеток за 1 час (ЕД/мг/час, мкг/мг/час).

Классификация АТБ

1).Актиномицеты – продуцируют больш часть АТБ (4 тыс АТБ) 2)Мицелиальные (плесневые) грибы (2,5 тыс). 3)Бактерии (р.Bacillus, Lactobacterium, Lactococcus) I.АТБ актиномицетного происх: 1)Аминогликозиды: гентамицин, стрептомиц, неомиц. 2)Тетрациклины: окситетрациклин, диметилтетр, метациклин. 3)Актиномицины: удерж рост злокач новообр. Более 100 преп-в. 4)Макролиды: Эритромиц, олеандомиц, магнамиц. По биологич действию: 1.Поддерж рост ГР+ 2.Фунгициды (филанин, пимарицин). Подавляют рост м/о, устойч к пениц, стрептомиц и тетр. 5)Анзамицины: шир спектр, рифамицины использ при стрепт и кокк инфекц. 6)Новобиоцин: против Гр+ и нек Гр-, против м/о устойч к макролидам.

II.АТБ бактериальн происх. 1)Грамицидин, полимиксин, бацитроцины (род bacillus). Из мол-кисл-низины.

III. АТБ обр плесн грибами 1)пеницилл, естест происх: г.о. против Гр+, полусинт –более шир действие(ампиц, оксицилл) 2)Цефолоспорины-активность, токс. Полусинт: цефалоидин, -ризин, -мицин, гризеопульвин (трихотицин) – при лечении трихофитии др. грибковых заболеваний. По мех антимикр дейст: 1)ингибит синт клет стенки, 2)нар функц прониц мембран клетки, 3)подавл синтез НК, 4)нар синтез пурин и пиримидин оснований, 5)подавл синт белка, 6)ингибит клет дыхания, 7)ингибит окислит фосфорилир, 8)облад антиметаболическими свойствами, 9)иммунодепрессанты.

Направленный синтез АТБ.

Способы: 1)изменение усл культивирования (гл обр состав пит среды), 2)введение в среду специфич ингибиторов, 3)получение мутантов, 4)воздействие на АТБ м/о-ми или их токсинами.

Этапы пром культивирования. 1)Биосинтез (синт преимущ в фазе стационарного максимума, большая часть продуцентов чувств к своим АБ в фазу лог роста. Малочувствит в фазу стацион максимума или вообще ничего не чувствует. Необходимо быстро пройти ф логар роста и долго удерж-ся в ф стацион максимума.2) предварит обработка биомасс: определение клет биомасс от культур жидкости. АТБ могут накапливаться: внутриклеточно, в культ жидкости, и там, и там.и3) выделение очищен АТБ. Зависят от хим строен, места нахождения АТБ. а)экстракция, б)осаждение, в)сорбция, г)упаривание, д)сушка.4)изготовление лекарств форм, их расфасофка. Важна хим чистота, отсутствие примесей. 5)биолог и фармак контроль.

Применение пробиотиков.

1965-впервые предлож как антаг АБ-кам. Это микр метабол-ы стимулир рост м/о. Сейчас: леч-профил средства, корм добавки, содерж жив м/о, реже их метаболиты. Действие направлено на регуляцию киш микрофлоры. В киш 17 сем м/о (45 родов, 400 видов). Различают резидентную и случайную микрофлору. Основа нормальн микрофлоры составл облигатные анаэробы. Взимоотношения: 1)индиффер, 2)конкуренц, 3)мутуализм. Система саморегулируется Если воздействие неблагоприятн факторов приводит к преобладанию транзиторной м/флоры – дисбактериоз.

Применение пробиотиков.

1965-впервые предлож как антаг АБ-кам. Это микр метабол-ы стимулир рост м/о. Сейчас: леч-профил средства, корм добавки, содерж жив м/о, реже их метаболиты. Действие направлено на регуляцию киш микрофлоры. В киш 17 сем м/о (45 родов, 400 видов). Различают резидентную и случайную микрофлору. Основа норм микрофлоры сост облигатные анаэробы. Взимоотношения: 1)индиффер, 2)конкуренц, 3)мутуализм. Система саморегулируется Если воздействие неблагоприятн факторов приводит к преобладанию транзиторной м/флоры – дисбактериоз.

Характаристика норм микрофлоры орг жив.

Большая часть в рубце – бифидобактерии-24 вида (80-90%). 40%: b.globosum, b.adolescontis. 60%-др виды: b.pseudolongum, b.thermophilium, b.animalis. Ни у одного жив не выделена b.bifidum. 10⁸-10¹² – в фекал

Основные технол пр-ва пробиотиков.

Выпускают жидкие и сухие препараты.1)АБК, ПАБК, лактицид. Культивир на жидк пит средах (цельное молоко, гидролизат молока, казеина, обрата, ЗЦМ, солод, овощные отвары. Культура фасуется. «+» - готовят в любых условиях, «-» - плохо сочет с сухим типом кормления, большие объемы-большие расходы на транспортировку, небольшой срок хранения (до 6 мес), нестандартны по содерж бактерий, не содержат бифидобакт. Дозы: птицам-1-3мл/сут, поросята-10-20, телята-50-100. 2)Стрептобифид, лактобифидок (для всех видов). Хранение более 1года. Технология: культивир производств-х штаммов на пит средах. Осн лек форма – лиофильно высушенный таблетир препарат. Сушат биомассу, затем смеш с формообр (лактоза, тальк, стеарат Са или Мn) добавками и штампуют.

Контроль. 1)Числа жизнеспособ кл-к в дозе или весовой ед препарата. Кол-во в норм-тех документах. 2)бак контроль – не должны содерж пат микрофлоры или незначит кол-во (не более 10³-10⁴) 3)Безвредность – биопроба на животных. 4)контроль остаторчной влажности (при лиофил 3-5%, сорбция 5-7%). 6)Проверка антагонистической активности штаммов.

Методы контроля ветеринарных билогических препаратов.

Государственный надзор и контроль за производством и качест­вом биологических препаратов для ветеринарии и животноводства, из­готовляемых на предприятиях биопромышленности MСX РФ, других ве­домств и министерств (в том числе поступающих из-за рубежа), осу-тся Всероссийским Государственным научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ). В задачу такого надзора и контроля входят: 1) государственный учет имеющееся в системе МСХ PФ, а также пос­тупающих из-за рубежа и высылаемых в зарубежные страны культур микроорганизмов, токсинов и ядов животного и растительного проис­хождения; 2) хранение и поддержание национального фонда высокоценных штам­мов культур микроорганизмов, используемых для производства препа­ратов и научно-исследовательских целей; 3) проведение экспертизы новых фармакологических препаратов и различиях веществ, предлагаемых для ветеринарных и животноводчес­ких целей научными учреждениями России и зарубежными фирмами. В настоящее время все препараты, применяемые в животноводстсве и ветеринарии, систематически подвергаются государственному контролю, осуществляемому государственными контролерами ВГНКИ, работа­ющими непосредственно на биопредприятиях. С этой целью на каждом биопредприятии создаются контрольные лаборатории во главве с госу­дарственным контролером (заведующим отделом биологического контро­ля при биопредприятии). Государственные контролеры на биопредприятиях являются штатными сотрудниками ВГНКИ. Они обязаны осуществлять контроль за технологией изготовления препаратов и за качеством готовой продукции в соответствии с требованиями нормативно-технической документации (НТД). Государственные контролеры имеют право полностью или частично приостанавливать производство и выпуск биопрепаратов в тех случаях, когда нпрусаотся требования нормативно-технической документации и не принимается меры для устранения причин изготосления недоброкаче­ственно продукции. На кажды йпрепарат, выпускаемый биопредприятием, должна иметься НТД, в кот. входят: 1) инструкция по изгготовлению и контролю препарата, утв. разработчиком данного препарата, содержащая: общие сведения о препарате и его назначении; характеристику производственных штам­мов микроорганизмов и порядок работы с ними при изготовлении пре­парата; подробное изложение технологического процесса производст­ва препарата; методы контроля готового изделия;, условия хранения препарата; правила по соблюдению санитарного режима и мер безопас­ности при изготовлении и контроле препарата;2) технические условия, утверждаемые Департаментом ветерина­рии МСХ РФ и регистрируемые в Государственном комитете стандартов, включающие: технические требования к препарату; правила приемки его Госконтролером предприятия-изготовителя {методы испнтаний пре­парата на его соответствие требованиям НГД с указанием ГОСТов и ТУ на используемые при этом оборудование, материалы, реактивы, а также порядок транспортировки и хранения; перечень гарантий, кото­рые должны обеспечиваться предприятием-изготовителем; 3) наставление по применению препарата, утверждаемое Департа­ментом ветеринарии МСХ РФ, в котором содержатся: общие сведения о препарате (внешний вид, назначение, срок годности, правила хране­ния); сведения о его фармакологических свойствах, подробное изло­жение порядка его применения. Осуществляя свои контрольные функции, государственнне контро­леры обязаны руководствоваться требованиями НТД. Выпуск препаратов с биопредприятий .в ветеринарную практику допускается лишь при ус­ловии прохождения ими следующих контролей: контроль безвредности, микробиологический контроль, контроль специфической активности.

Контроль безвредности биопрепаратов проводят на ларбораторнта или сельснохозяйственнмх животных. Для живых инактивированных вакцин, лечебно-профилактических сывороток и иммуноглобу.пинов этот показатель определяют на основании данных о выживании или гибели прививаемых животных, клинических признаков их переболенания, из­менений массы животных и бактериологических показателен с иденти­фикацией выделяемой от них микрофлоры. При решении вопроса о безвредности препарата следует учиты­вать, что поствакцинальные осложнения могут быть обусловлены рядом причин: прямым к опосредованным токсическим эффектом, который уста­навливают методами фармакологичесшгх исследований, определяя степень изменения физиологического состояния животных; недостаточной аттенуацией культуры вакпионного штамма или неполной инактивацией производственных культур, которые определятют в опытах на животных, чувствительных к данной инфекции; специфической и неспецифической сенсибилизацией, в том числе гиперчувствительностью замедленного типа. Для определения безвредности вакцины или сыворотки вводят жи­вотным" парентерально. Дозы препарата, применяемые при проверке на с/х животных, должны превышать рекомендуемые для практического использования в 2-10 раз; а при проверке на лаборатор­ных животных - приближаться к максимально переносимым. Срок наблю­дения за животными, в течение которого они должны остаться здоровы­ми, не менее 10 дней. Кроме того, контроль безвредности лечебно-профилактических сывороток включает проверку их апирогенности. Апирогенность проверяют на 3-х кроликах породы шиншилла массой 1,5-2,0 кг. Перед опытом кроликов в течение 3-х дней взвешивают и измеряют температуру их тела, которая должна быть в пределах 38,6-39,8 °С. Кроликов, имеющих тен­денцию к снижению массы тела и повышению температуры тела, в опыт не берут. Испытуемый препарат перед введением подогревают до 37 °С и вво­дят кроликам в ушную вену в количестве I мл/кг массы. Через I, 2 и 3 ч после введения препарата у кроликов измеряют температуру тела. Она не должна повышаться более, чем на 0,8 °С. Контроль безвредности антибиотиков обусловлен тем, что при антибиотикотерапии возможны осложнения, в виде прямых токсических реакций и непрямых побочных реакций. Прямых побочные реакции - обусловлены органотропностыо и специ­фичностью эффекта, зависят от дозы, метода и длительности применения антибиотиков. Могут проявляться поражением почек, печени, нервной и кроветворной систем, нарушением деятельности велудочно-кишечного тракта.

Непрямые побочные реакции неспецифичны для антибиотиков и могут быть вызвали веществами различной природы. К такого рода осложнениям относятся; гиперчувствительность, реакция бактериолиза (освобожде­ние большого количества эндотоксинов при гибели и разрушении микроорганизмов), дисбактериоз (качественные и количественные изменения нормальной микрофлоры желудочно-кишечного траста) и др. Исходя из вышеизложенного, антибиотики контролируют в отноше­нии острой и хронической токсичности. Для контроля острой токсичнос­ти определяют: максимально переносимую дояу (МПД) препарата, дозу, рнзнвающую гибель 50% подопытних животных (LД5о), дозу, вызывающую гибель 100% подопытных животных (LD 100). Для контроля хронической токсичности изучают влияние препарата на различные органы и системы организма подопытных животных при его длительном применении. Микробиологический контроль. В жиоых бактерийных и вирусуых вакцинах не должно содержаться посторонней микрофлоры (контаминан-тов); инактивированные вакцины, анатоксины, лечебно-профилактичес­кие сыворотки и иммуноглобулины должны быть стерильными (свободны­ми от жизнеспособной микрофлоры). Чистоту живых и стерильность инактивированных вакцин, сыворо­точных препаратов и анатоксинов проверяют высевами на специальные питательные среды. Для отого.применяют МПА, МПБ с глюкозой; буль­он и агар Мартена; МППБ под маслом; бульон и агар Сабуро или Чапека и другие среды, обеспечивающие рост как анаэробных, так и аэробных бактерий и грибов. Посевы выдерживают при температуре 36-37 °С. Из флаконов с по­севами инактивированных вакцин» анатоксинов, сывороточных препара­тов там, где нет роста, через 5-6 дней делают пересевы на аналогич­ные среды. Первичные посевы выдерживают при указанной температуре 15 дней. Среды Сибуро или Чапека для выявления грибковой микрофло­ры выдерживают 15 дней -при комнатной температуре (20-25 °С). Пере­севы выдерживают не менее 10-ти дней. Для выяснения стерильности антибиотиков используют, как прави­ло, два метода. Первый метод связан с инактиваиией антибиотика биологическим инактиватором (например инактивация бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на его основе, ферментом пенициллиназой) и последующим высовом на питательные среды. При втором методе раствор антибиотиков пропускают через мембранные филь­тры с диаметром пор не более 0,75 мкм. После атого фильтры перено­сят на плотные или жидкие питательные среды. Вторым методом пользу­ются в тех случаях, когда для антибиотика не имеется биологическж инактиваторов его активности.

Контроль специфической активности. Нммуногенную специфическую активность вакцин и анатоксинов оценивают в опытах прямого заражения иммунизированных животных пли косвенными методами. Контроль иммуногенности в. опытах пряного заражении возможен в двух различных вариантах. При порвом иммуногенность оценивают пос­ле однократного (или двукратного) введения препарата не менее чем 10-ти подопытным животным. В контроле должно быть также 10 живот­ных, равноценных подопытным по степени чувствительности к заболева­нию. Всех животных через определенный срок после вакцинации (14-21 день) заражают соответствующей культурой контрольного вирулентного штамма в количестве 5-10 (а в ряде случаев 100-200) ЛД50 или ИД50. Вакцину считают иммуногенной при выживании без признаков за­болевания не менее 8 вакцинированных и гибели или заболевании не менее 8 контрольных животных. Допускается заболевание 3 вакциниро­ванных животных при 100%-ной гибели (заболевании) контрольных. Второй вариант контроля иммуногенности вакцин и анатоксинов заключается в определении ЛД50 или ИД50 контрольного вирулентного штамма для вакцинировали и кнтактных (контрольных) животных. Многократное (в 5-10 и более раз) увеличение величины ЛД50(ИД50) для привитых животных по сравнению с контрольными свидетельствует об иммуногенности препарата. Косвенными показателями иммунологической специфической актив­ности биопрепаратов могут быть алнтигенность, характеризующая уро­вень образования специфических антител в крови вакцинированных жи­вотных, и концентрация антигенов в прививочной дозе. Специфическую активность сывороточных лечебно-профилактичес­ких и диагностических препаратов определяют путем измерения эффекта, присущего препарату данного вида. Так, лечебно-профилактические сыворотки проверяют на превен­тивные свойства на восприимчивых крупных и лабораторных животных. Для этого сыворотку вводят животным внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. Через 24 ч после инъекции сыворотки животкых заража­ют подтитрованной дозой контрольного вирулентного штамма соответст­вующего микроорганизма. Подопытные животные должны оставаться здо­ровыми минимум 14 дней при гибели или переболевании контрольных. Кроме того, контроль специфической активности лечебно-профилак­тических сывороток мокет быть основан на определении концентрации специфических антител в опытах нейтрализации этими сыворотками со­ответствующих инфекционных агентов кли их токсинов. Чем меньше до­за сыворотки, способная нейтрализовать действие определенной дозы инфекционного агента или токсина, тем выше ее активность. Диагностические сывороточные препарата проверяют в соответстующих реакциях (РА, РН, РДП, РТГЛ, РНГЛ, РСК и др.). Активность сывороточных препаратов любого типа определяют по сравненшэ со стандартными (эталонными) референс-препаратами. Для этого испытуемую сыворотку проверяют параллельно со стандартной, а затем рассчитывают дозу испытуемой сыворотки, эквивалентную по эффекту единице активности стандарта. На каждую проверенную серию биопрепарата заполняют паспорт, п котором укалывают основные технологические, лечебно-проклэктичоские и другие специфические показатели: номер серии; дату изготовле­ния; объем серии (в литрах, дозах); объем препарата в расфасовоч­ных емкостях; результаты, полученные при проховденни препаратом контролей; метод и сроки хранения. На каждой серии биопрепарата, признанной пригодной для исполь­зования в животноводстве и ветеринарии, на предприятии-изготовите­ле оставляют арбитражные образцы, которце должны сохраняться в ус­ловиях, определенных требованиями НТД, в течение всего срока годно­сти данной серии препарата.

Несколько тысячелетий использовались микробные фермы в пивоварении и получения винных напитков, консервирования и хранения пищи. История промышленной м/б и ее современное состояние, определяемое как биотехнология, позволяет проследить тесную связь фундаментальных и прикладных исследований со времен Пастера. Приблизительно столетие назад исследования Пастера были направлены на решение практических задач на причину порчи вина привили к становлению биотехнологии. Доказали гниение и брожение м/о. Были сделаны реальные предпосылки для развития прикладной технолологии м/б, а позже и биотехнологии в современном понимании. Следующий этап: связан с открытием в 1940 году А. Флемингом пенициллина. Это обусловило разработку методических приемов, сыгравших решаущую роль в развитии молекулярной биологии и дало мощный толчок важнейшим изменениям в фармацевтической промышленности, резкому повышению значения технических наук биопромышленности. В середине 60-х годов многие открытия в биохимии, генетике, клеточной и молекулярной биологии произвели революционные изменения в промышленной м/б и дали начало биотехнологии в современном ее понимании как науке. Значительными открытиями являлись определение полной структуры белка интерферона, 2-х нитей ДНК, расшифровка генетического кода и его универсальности для бактерий, растений, животных. В результате генетической информированности, т.е. взаимосвязь между генетическим кодом и структурой белка стали доступны для изучения. В 70-х годах в результате усовершенствования аналитических методов появилась возможность автоматического определения структуры белков, их аминокислотной последовательности, разработать методы и приборы для автоматического химического анализа НК, а следовательно, и генов. Были искусственно синтезированы молекулы биополимеров, гены, гормонов (СТ и инсулин человека). Эти гены были введены в клетку E. сoli и такие E. сoli стали продуцировать гормоны человека. Этим было положено принципиально новой технологии получения рекомбинантной ДНК или генной инженерии ( 70-79 года). Методы генной инженерии открывают дополнительные возможности для уже освоенных биопроцессов (получение штаммов-мутантов суперсинтезом веществ) и дает оригинальный способ получения новых, ранее не доступных веществ, позволяет осуществить новые процессы. Т.о. генную инженерию можно рассмотреть как одну из методов генетики, так и биотехнологических процессов. Появления термина биотехнология связано с возникновением генной инженерии. Большие успехи получены с технологиями ферментов и м/о, биороизводством аминокислот, белка одноклеточных, превращения стероидов, культивирование клеток животных и растений. Во всех случаях эволюция биологии и биотехнологии были неотделимы от главных этапов в развитии знаний об основополагающих механизмов жизнедеятельности. Сейчас разработка и освоение биотехнологических систем занимает важнейшее место в народном хозяйстве и достижения в этой отрасли одна из центральных задач в глобальной экономической политике. Многие страны накопили опыт производства биотехнологической продукции для с/х, пищевой промышленности, фармацевтической и химической медицины, ветеринарии. Отечественная биотехнология – наша промышленность стала производить м/б белок (ежегодно около 1 млн. т. на основе гидролиза древесины и с/х отходов и очищенных парафинов нефти. Ежегодно выпускают  20 тыс. т. лизина, одна тонна экономит 50 т. фуражного зерна). Создана крупная биопромышленость по выпуску антибиотиков, ферментов, инсектицидов, освоено культивирование клеток животных и растений. Важную область медецины и ветеринарии биотехнология состовляет производство вакцин, гормонов, витаминов, биостимуляторов, антибиотиков, пробиотиков, диагностических и лечебных сывороток на бипредприятии. В научном пути развития битехнологии выделяют 4-е этапа: 1) Битехнология пищевых продуктов, в т.ч. продуктов брожения; 2) битехнология органических кислот, растворителей и получения биомассы нестерильных условиях; 3) битехнологическе процессы в стерильных условиях, включая получение вакцин и антибиотиков; 4) современный этап – применение ферментов и клеток, достижения молекулярной биологии, генной и клеточной инженерии (рекомб. ДНК др.). Развитие новых технических средств в виде биодатчиков, биореакторов, контрольно-измерительная система, техники очистки и концентрации и ЭВМ.

Определение биотехнологии как науки.

До 80-х годов биотехнология определяли терминами промышленной микробиологии: техническая биохимия, технология ферментов, прикладная генетика, биоинженерия и т.д. Новые открытия объединили разрозненные направления. Битехнология стала наукой о практическом использовании биологии в целом, а не отдельных ее ветвей. До последнего времени биотехнология была полем деятельности микробиологов и энзимологов и ее можно было определить как прикладную науку об использовании биологических процессов в технике и промышленности. Если энтерпретировать сущьность биотехнологии применительно к технологии пищевой, мясо- и молокоперерабатывающей промышленности, то больше подходят определение биотехнологии как комплекса знаний о целенаправленном научно-обоснованном использовании биопроцессов, переработки и использования сырья. Применительно к ветеренарной биопромышленности, это конструироание и получение биопрепаратов по определенным техногиям. В 1987 году латышские ученые в книге биотехнологии дали определение: биотехнология – это управляемая получением, полезная для народного хозяйства, медецины, целевых продуктов с помощью биологических агентов ( м/о, вирусы, клетки животных и растений) и с помощью внеклеточных веществ и компонентов клеток. Это не окончательная формулировка понятия биотехнологии как науки правильно определить как науку о закономерностях поведения биологических систем при управляемом, контролируемом получении целевых продуктов и решения народнохозяйственных задач с основных билогических и технических позиций. Из такого определения можно сформулировать теоретические и практические задачи. Теоретичесая задача – это изучение и понимание закономерности поведения и реакции биологических систем в специальных искусственных, создаваемых условиях максимально способствующих проявлению генетических свойств или активности биологического агента, т.е. целевого производственного назначения. Т.к. поведение биосистемы динамично и проявляется в форме последовательности процесса управляемого инженернотехническими средствами и технологическими решениями, то возможно при этом биотехнологический процесс можно признать в качестве предмета или объекта биотехнологии. Биотехнологический процесс складывается из ряда последовательных производственных этапов работы. В любом биопроизводстве следует выдилить основные компоненты биотехнического процесса: 1) биологические агенты (м/о, вирусы, культивированные клетки тканей, внутриклеточные продукты); 2) субстракты (питательные среды, сырье, отходы производства); 3) аппаратура; 4) совокупность методов для управления процессом (технология); 5) конечный целевой продукт. Они специфичны для каждого производства. Прикладные задачи: технико-экономическая оценка альтернативного получения продукта. Особенно важна ранняя оценка.

Критерии: 1) продукт производства не может быть получен без биологического агента; 2) стоимость продукта превышает стоимость сырья, что продукт может все окупить; 3) получение продукта б/т путем является единственным экологической альтернативой. Вероятность осуществления б/т процессов не превышает 15-20% (США). Из них 60% достигает завершения, 30% - коммерческое освоение, 12% - прибыльн. оказ.

Б/т связана со многими науками; инженерно-технич., технич.-экономическими, химико-физич. и др.

Модификационная изменчивость м/о.

На организм влияет внешняя среда. Комплекс признаков, проявляющийся у м/о в конкретных условиях существования называется фенотипом. М/о могут иметь несколько фенотипов при одном генотипе. При изменении условий культивирования (в пределах адаптационной способности) - м/о преобретает определенный фенотип. Это выявляется в скорости роста, жизнеспособности. Появившийся новый фенотип вытесняет исходный. Эти различия – результат взаимодействия генотипа и среды. Модификации – внешние различия в пределах штамма. Модификационная изменчивость – смена фенотипов при смене условий существования. Фенотип – совокупность наблюдаемых признаков м/о. Генотип – совокупность наследственных задатков. Адаптация – изменения на уровне фенотипа. Она не затрагивает клеточный генотип. Два типа генов у м/о: 1) структурные – отвечают за синтез специфического белка; 2) регуляторные - отвечают за синтез продуктов белковой или небелковой природы, выполняющие роль регуляторов б/х активных веществ. Структурные – зависят от генотипа и малоизменяемы. Регуляторные – функция смещения под действием внешней среды. Регуляторные гены могут включать и выключать генетический код вплоть до полной остановки. Современная генетика доказала, что наследуются генетические признаки и норма реакции. Фенотипические изменения проявляются у большинства особей. Они наблюдаются только в условиях действующего фактора. Этот процесс управляем. Каждый процесс включает несколько ферментативных реакций, регулируемый на двух уровнях: синтез фермента и изменение его активности. Цель регуляции: обеспечить скорость синтеза определенных белков (ферментов) и синтеза суммарного клеточного белка. Это определяется частотой транскрипции. Многие ферменты образуются непрерывно (конструктивные ферменты). Образование катаболических ферментов регулируется путем индукции через субстрат, имеющийся в среде. Индукция и репрессия действуют медленнее через субстрат. Образование анаболитических ферментов регулируется путем репрессии конечных продуктом, который накапливается. Ферменты, необходимые для синтеза основных компонентов образуются непрерывно. Но, если если появляется избыток продукта, то синтез подавляется.

Понятие о гомологии ДНК как критерии родственности определяемых форм.

А+Т/ Г+Ц у разных м/о от 0,69 до 1,83. У близкородственных м/о это отношение строго определено. Коэффициент соотношения комплементарных оснований сейчас принят в качестве коэффициента видоспецифичности.

Битехнические основы селекции производственных штаммов м/о.

Особенности строения и финкционирования наследственого аппарата прокариота; 2) модификационная изменчивость м/о; 3) принципы и способы получения мутантных штаммов м/о; 4) принципы и способы получения рекомбинантных штаммов м/о; 5) методы селекции и генная инженерия. Наследственные свойства м/о являются его важным признаком. Биологические предприятия получают штаммы в готовом виде с паспортом. Из-за нарущений операций по применению, сохранениюю ист. возникших отклонений. Отклонения возникают из-за нарушения б/т процесса (неподходящие условия для м/о). Основная часть селекционной работы проводится в научных учереждениях. Успех в б/т промышленности определяется глубокими знаниями законов генетики, строения и функционирования прокариотов. Всякое живое существо сходно с предками. Сохранение специфических свойств в ряду поколений – наследственость. Вся информация о признаках м/о сосредоточена в генетическом аппарате. Генетический аппарат с одной стороны стабилен, а с другой – пластичен. Это важная особенность м/о. До 40-х годов думали немногие, что бактериии обладают наследственностью. Но пришли к выводу, что м/о подчинены общим законам генетики: 1) Носитель информации – ДНК (двойная спираль, замкнутая в кольцо, в структурном отношении соответствует 1 хромосоме). Информационные свойства хромосом определяют специфику наследования четырех нуклеотидов. Хромосома в химическом и функциональном отношении неоднородна. каждый детерменирующий участок называется геном. Гены расположены линейно. Совокупность всех генов клетки – генотип, в котором полностью заложена информация о всех свойствах, присущих клетке. В ряде случаев у м/о есть нехромосомные ДНК, которые сосредоточены в плазмидах. ДНК – полимер, состоящий из однотипных, более простых молекул. В состав ДНК входят: 1) остаток фосфорной кислоты; 2) доиксирибоза; 3) азотистые основания: - пурины (аденин, гуанин); - пиримидины (тимин, цитазан). Их соединение между собой представляет мономер – нуклеотид. Специфика индивидивидуальной ДНК различна в количестве N-ых оснований и их чередовании в дальнейшем по длине полимера. Отношение А к Т и Г к Ц очень близки к 1. Суммарное отношение А+Т/ Г+Ц - широко варьирует взависимости от вида . Макромолекула состоит из двух цепей, наличие А или Г в одной, соответствует наличию Т и Ц в другой. Цепи соединены водородными связями. Когда микробная клетка делится происходит раскручивание ДНК и цепочки расходятся. К ним присоединяются соответствующие остатки. Т.о., сформировывается комплиментарная дочерняя цепь, в следствии этого образуется 2-я спираль. Этот процесс называется реплекацией ДНК. Сама ДНК не служит матрицей. Биосинтез белка происходит на рибосомах. Информацию передает и-РНК. В РНК замена дезоксирибозы на рибозу, а тиамина на урацил. РНК синтезирует на одной из цепей ДНК. При синтезе матричной ДНК копируется информация (транскрипция). репликация ДНК (репликация) м-РНК  (трансляция) белок. Специфическая информация, содержащаяся в гене определяется последовательностью оснований в цепи ДНК. Для перевода на язык аинокислот служит специфический код. Каждые три нуклеотида составляют кадон. Он кодирует одну аминокислоту. В трансляции учавствуют матричная и транспортная ДНК. Присоединение аминокислот к т-РНК осуществляется с помощью ферментов – синтетаз. Рибосома перемещается вдоль м-РНК, следовательно идет синтез белка (наращивание цепи). Механизм трансляции отличается высокой точностью, но ошибки бывают (10^-4). Эти ошибки при трансляции не воспроизводятся, если они не закодированы. Генетический материал, необходимый для жизнедеятельности м/о представлен одной хромосомой. Она гаплоидна. Плазмиды – кольцевые замкнутые молекылы, реплицируются они автономно. О них судят по изменению признаков (устойчивость к лекарственным препаратам, изменения в метаболизме и т.д.).

Принципы и способы получения мутантных штаммов м/о.

1)мутации и механизм их возникновения; 2) спонтанные и индуцированные; 3) фенотипические проявления и оценка мутации; 4) реверсия и ревентарные штаммы. Наследственные признаки с изменением генатипа – наследуются (генатипические изменения, которые проявляются в двух формах: мутациях и рекомбинациях генов). Механизмы возникновения мутаций. Внезапно возникшие и генетипически наследуемые изменения в генетическом аппарате клетки. Доказать скачкообразность изменений очень трудно, т.к. отличить фенотипическую адаптацию от генетической очень сложно. Фенотипическая проявляется у всех особей популяции, а генетическая у отдельных клеток. Такие клетки более устойчивы, жизнедеятельны. Мутации у бактерий носят спонтанный и ненаправленный характер (в естественных условиях). Различают: цитоплазматические мутации, затрагиваюцие внехромосомные детерминанты и хромосомные детерминанты. Хромосомные мутации: 1) изменение числа хромосом – у бактерий нет, т.к. только одна хромосома; 2) изменение числа и последовательности генов – хромосомные перестройки; 3) изменения непосредствено в гене (количественое и качественое изменение в ДНК) – внутригенные мутации. 2. Можно разделить на четыре вида: 1) выпадение участка хромосомы – делятация; 2) удвоение и умножение числа отдельных генов – амплификация; 3) вставка участка хромосомы в другие места – транспозиция; 4) изменение порядка генов в хромосоме – инверсия. В результате хромосомной перестройки увеличивается или уменьшается количество метаболитов и продуктов жизнедеятельности клетки. 3. Мутагенные – изменение последовательности оснований ДНК в пределах одного гена: 1) выпадение или вставка азатистых оснований (нарушение процессов считывания – транскрипции ); 2) транзиция – замена одного пуринового основания на другое (А на Т); 3) трансверция – замена пуринового основания на перимидиновое (Г Т, Ц). Появляется мутантный фенотип м/к с полной или частичной измененной функцей измененного гена. появляются м/к с измененными свойствами. II. Раздница между спонтанными и индуцированными мутациями прежде всего по происхождению. Численная доля мутаций в клеточных популяциях различна для разных признаков и варьирует от 10^-4 до 10^-11. Частоту мутаций можно увеличить - в ответ на воздействие факторов внешней среды – мутагенные факторы, здесь можно говорить об индукции штаммов. Включение аналогов азотистых оснований. Мутагенные факторы: химическое изменение оснований (азотистая кислота, нитриты), физические (ультрафиолетовые лучи, ионизирующее излучение). Всякая мутация – это внешние изменения в генотипе. Она может быть и положительной и отрицательной. Эффект мутирования для нас с экономической точки зрения, например: Снижение вирулентности м/к для него плохо, а с точки зрения получения вакцины – хорошо. Это зависит от направления работы. Мутации реализуютяс по тем же законам, что и другие генетические признаки. Некоторые мутации не проявляются внешне и их проявление зависит от внешней среды. Может изменение функции ферментов, вплоть до ее потери, и если они отвечают за важные функции, то это может привести к гибели. Чтобы мутация проявилась необходимо провести 2-3 цикла размножения м/к, тогда этот признак закрепится. Способность мутантов к реверсии, т.е. к обратному мутированию. При внутригенной супрессии (подавлени) вторая мутация возникает в том же гене, что и первая и приводит к восстановлению функции белка (1000 –2000 ферментов у E. coli.). При внутригенной супрессии вторая мутация может затрагивать второй ген (даже супрессор) и из-за этого активность поврежденного белка восстанавливается не более, чем на 10% и появляются штаммы супрессорные ревертанты. Они обладают пониженой вирулентностью (их используют для приготовления вакцин – против сальмонеллеза). Новый фенотип мутировавшего штамма проявляется только тогда, когда измененный ген начинает функционировать. Методы выявления мутировавшего штамма: Высев большого числа клеток на твердую среду с ингибитором; Применение антибиотиков; Выращивание субстратов, которые лимитируют рост. Рекомбинантные штаммы микроорганизмов. Методы: коньюгация, трансдукция, трансформация. Стабильность генетического аппарата не стабильна и при всей надежности изменения являются его свойствами. Для прокариотов большая склонность к изменению. В результате появляются новые наследственные признаки, генофонд возрастает. Генетическая информация извне не приносится, имеется путь переноса генов. Особый путь переноса генов (горизонтальная передача) между бактерий одного вида и разных видов и возникновение на этой основе новых особей с рекомбинантным генотипом. В результате рекомбинантные изменения потомственные, которые наследуются частично качество родителей. Это осуществляется половым путем. Рекомбинация у м/к осуществляется тремя способами: коньюгация, трансдукция и трансформация. Независимо от этих способов ДНК переносится от бактерии-донора к м/к-реципиенту. После переноса в клетку-реципиента происходит рекомбинация, ДНК донора встраивается в генетический аппарат реципиента и образуется клетка-рекомбинант.

Коньюгация – перенос генетического материала путем прямого контакта между двумя клетками. Из 10^-9 – только 100 клеток обладают способностью этого мутанта. Не все клетки наделены свойствами донора (связано с наличием полового фактора в клетке – фактор F (плодовитости – кольцевая двухцепочечная молекула ДНК - плазмида)). Свойства половой молекулы: 1) ответственная за процесс коньюгации и гены отвечают за половые волоски (F-пили). При коньюгации таких клеток частота переноса F-фактора близка к 100% и клетка-реципиент преобретает качества донора. Плазмиды и F-пили – не являются обязательным компонентом клетки. Большинство плазмид обладают способностью передачи от клетки-донора к реципиенту при коньюгации – коньюгативные плазмиды. Но есть плазмиды, переходят с помощью F-пили, а самостоятельно не передаются – трансмиссивными или неконьюгативными плазмидами. Могут быть свободные или связаннае с ДНК хромосом – плазмида эписома. Коньюгацию часто применяют при конструировании производственных штаммов м/к: 1) увеличение числа генов; 2) увеличение числа копий плазмид на клетку (до 3-х тысяч).

Трансдукция – передача ДНК от кл. донора к реципиенту при участиии бактериолога. Некот. бактерии преоб-ся в бактериофаги, кот. наряду с собствен. ДНК имеют и ДНК бактерий – трансдуцирующие фаги (не сразу вызывают лизис) – умеренные фаги. Они ничем не отличаются от обычных бак. фагов. Различают 2-а типа трансд.: 1) общая неспецифическая; 2) специфическая. При общей тр-ии – во вновь образ. капсиде упаковывается фрагментом ДНК бактерий с неизвестными св-ми. Специф. – захват. опред. участок ДНК бакт. Фрагменты хромосомы ДНК и фрагменты или в целом ДНК плазмид.

Трансформация – гены б. могут перех. из кл. в кл. без всяких контактов и переносчиков. Передача при помощи раствор-й ДНК. Это может быть при самолизисе при t-ых, физ. воздействии. Трансф. может ос-ся хромосомной и плазмидной ДНК. Трансф. только комплиментн. кл-ки способные адсорбировать и перед-ть эту к-у и таких клеток не более 15% в популяции. На это влияет влажность. Проникать в кл-ку может ДНК выдел. из разных участков, но включ. может только с опред. степенью гомологичности. С помощью трансф. можно вводить в геном опред. новые св-ва, так же удалять вредные (синтез ферментов, полисахар., устойчивость). Из 3-х основных процессов наиб. совершенны конъюгация. Эф-ть генетич. рекомбинации сдерживается многими барьерами. Метод получения рекомб. молекул ДНК или генетической генной инженерии – подход на предотвращение сдерживания генетич. рекомбинации.

Принципы и способы получения мутантных штаммов м/о.

мутации и механизм их возникновения; 2 ) спонтанные и индуцированные; 3) фенотипические проявления и оценка мутации; 4) реверсия и ревентарные штаммы. Наследственные признаки с изменением генатипа – наследуются (генатипические изменения, которые проявляются в двух формах: мутациях и рекомбинациях генов). Механизмы возникновения мутаций. Внезапно возникшие и генетипически наследуемые изменения в генетическом аппарате клетки. Доказать скачкообразность изменений очень трудно, т.к. отличить фенотипическую адаптацию от генетической очень сложно. Фенотипическая проявляется у всех особей популяции, а генетическая у отдельных клеток. Такие клетки более устойчивы, жизнедеятельны. Мутации у бактерий носят спонтанный и ненаправленный характер (в естественных условиях). Различают: цитоплазматические мутации, затрагиваюцие внехромосомные детерминанты и хромосомные детерминанты. Хромосомные мутации: 1) изменение числа хромосом – у бактерий нет, т.к. только одна хромосома; 2) изменение числа и последовательности генов – хромосомные перестройки; 3) изменения непосредствено в гене (количественое и качественое изменение в ДНК) – внутригенные мутации. 2. Можно разделить на четыре вида: 1) выпадение участка хромосомы – делятация; 2) удвоение и умножение числа отдельных генов – амплификация; 3) вставка участка хромосомы в другие места – транспозиция; 4) изменение порядка генов в хромосоме – инверсия. В результате хромосомной перестройки увеличивается или уменьшается количество метаболитов и продуктов жизнедеятельности клетки. 3. Мутагенные – изменение последовательности оснований ДНК в пределах одного гена: 1) выпадение или вставка азатистых оснований (нарушение процессов считывания – транскрипции ); 2) транзиция – замена одного пуринового основания на другое (А на Т); 3) трансверция – замена пуринового основания на перимидиновое (Г Т, Ц). Появляется мутантный фенотип м/к с полной или частичной измененной функцей измененного гена. появляются м/к с измененными свойствами. II. Раздница между спонтанными и индуцированными мутациями прежде всего по происхождению. Численная доля мутаций в клеточных популяциях различна для разных признаков и варьирует от 10^-4 до 10^-11. Частоту мутаций можно увеличить - в ответ на воздействие факторов внешней среды – мутагенные факторы, здесь можно говорить об индукции штаммов. Включение аналогов азотистых оснований. Мутагенные факторы: химическое изменение оснований (азотистая кислота, нитриты), физические (ультрафиолетовые лучи, ионизирующее излучение). Всякая мутация – это внешние изменения в генотипе. Она может быть и положительной и отрицательной. Эффект мутирования для нас с экономической точки зрения, например: Снижение вирулентности м/к для него плохо, а с точки зрения получения вакцины – хорошо. Это зависит от направления работы. Мутации реализуютяс по тем же законам, что и другие генетические признаки. Некоторые мутации не проявляются внешне и их проявление зависит от внешней среды. Может изменение функции ферментов, вплоть до ее потери, и если они отвечают за важные функции, то это может привести к гибели. Чтобы мутация проявилась необходимо провести 2-3 цикла размножения м/к, тогда этот признак закрепится. Способность мутантов к реверсии, т.е. к обратному мутированию. При внутригенной супрессии (подавлени) вторая мутация возникает в том же гене, что и первая и приводит к восстановлению функции белка (1000 –2000 ферментов у E. coli.). При внутригенной супрессии вторая мутация может затрагивать второй ген (даже супрессор) и из-за этого активность поврежденного белка восстанавливается не более, чем на 10% и появляются штаммы супрессорные ревертанты. Они обладают пониженой вирулентностью (их используют для приготовления вакцин – против сальмонеллеза). Новый фенотип мутировавшего штамма проявляется только тогда, когда измененный ген начинает функционировать. Методы выявления мутировавшего штамма: Высев большого числа клеток на твердую среду с ингибитором; Применение антибиотиков; Выращивание субстратов, которые лимитируют рост. Рекомбинантные штаммы микроорганизмов. Методы: коньюгация, трансдукция, трансформация. Стабильность генетического аппарата не стабильна и при всей надежности изменения являются его свойствами. Для прокариотов большая склонность к изменению. В результате появляются новые наследственные признаки, генофонд возрастает. Генетическая информация извне не приносится, имеется путь переноса генов. Особый путь переноса генов (горизонтальная передача) между бактерий одного вида и разных видов и возникновение на этой основе новых особей с рекомбинантным генотипом. В результате рекомбинантные изменения потомственные, которые наследуются частично качество родителей. Это осуществляется половым путем. Рекомбинация у м/к осуществляется тремя способами: коньюгация, трансдукция и трансформация. Независимо от этих способов ДНК переносится от бактерии-донора к м/к-реципиенту. После переноса в клетку-реципиента происходит рекомбинация, ДНК донора встраивается в генетический аппарат реципиента и образуется клетка-рекомбинант.

Биотехнология культивирования мк. Организация б/т процесса начинается с физиологии мк. Цель б/т – базе понимания б/хим. и физиологич. процессов необходимо создать условия для производства штамма, при кот. получ. max целевого продукта (берут конкретные штаммы или первичные или вторичные метаболиты). 1) Оптимальная питат. среда и контроль за ее изменениями; 2) оптим. биологич. факторы и и контроль за их изменением и корректировка в случае необходимости; 3) правильность выбора конструкции или биореактора, вариантов культивирования.

Питательные среды и условия роста мк.

Пит. в-ва – это растворенные в воде соед-ия, из кот. мк строят свои кл. и получают энергию. Пит. среды должны отвечать след. требованиям: 1) должны присутствовать все элементы для строительства кл. и в доступных для мк формах; 2) по кол-м вкладам различают макроэлементы: С, О2, Н, N2, S, P, K, Ca, Mg, Fe; микроэлементы: Mo, Zn, Cu, Co, Mn и др. – в кот. нуждается кл, все мк, чаще входят в виде примесей в сам макроэлемент. Источником С и энергии: патоген. мк получают клеточный С из органич. в-в, кот. частично ассимилируются для построения кл, а частично – окисляются для получения энергии. Из природных органич. соед-ий преобладают полисахариды: целлюлоза, крахмал (использ. молек. глюкозы). Добавочные в-ва – факторы роста, эти в-ва входят в основной состав кл-и, но не все ор-мы способны синтезировать их сами: амк, пурины и перемидины, витамины. Мк, которые нуждаются в факторах роста называют – ауксотрофами, а мк, кот. не нуждаются - прототрофы (только мин. в-ва и С). S и N2 оба элемента сод-ся в кл. в восстан. форме (аминогруппы и сульфгидрид. группа) поглощается в окисленой форме, кот. мк и поглощаются в виде сульфата и нитрата, кот. усваиваются мк. О2 – главная функция О2 яв-ся акцептором Н при аэробном дыхании, сам восстан. до Н2О. Аэробы требуют наличие молекулярного О2 в среде. Атомарный в среде – для анаэробы. Факультативные анаэробы растут в присутствии атом. О2, так и без него, они дел-ся на аэротолерантные мк, кот. растут в присутствии ат. О2, использ. через брожжение, и собстсв. факультативных анаэробов. кот. использ. непосредствено О2 (энтеробактерии). Микроаэрофилы растут при атомарном О2, но пониженном порциональном давлении, им нужно в 30 раз меньше ат. О2. Сложные среды: когда пит. потребности мк изучены недостат., то используют сложные среды. Они готовятся с использ. дрожж. экстракта, мясн. бульона, дрож гидролизат или автолизат, пиптон. Твердые питательные среды: готовятся с добавлением агара (t плавл. 100, а t застыв.=40 и не использ. для пит. мк): желатины (неудобны, т.к. низкая t плавления); селикогели. Универсальных питательных сред нет. Все пит. среды делятся на: - простые (обычные) для культив. h пат. мк; - специальные п.с. (для выделения или выращивания чистых культур); - диорор-диагностические среды (!?). Чаще использ. спец. п.с., основой кот. служат простые пит. среды (МПБ, МППеч. (спец.), МПА, пит. желатин, основной гидролизат спец., печеночный бульон на мясном гидролизате, печеночный бульон на кислотном гидролизате из сгустков крови, перевар Хоттингера, среда К-Т, среда из гидролизата козеина). Физиология роста и фазы развития мк-й популяции в пит. среде. Под ростом поним. необратим.  кол-ва живого в-ва, связано с  делением кл. У многоклет. –  размера тела, у одноклет. – рост колоний,  массы кл.. У однокл. нужно отличать  числа кл-к и  числа массы. При опред. числа или массы использ. гомогенную суспензию кл. Определяют [ ] бакт. (число кл. в 1 мл раствора или -бактерий).  - кол-во мг бакт. в 1 мл, мг.

Методы опред. числа бактерий. Жизнеспос. кл., кот. могут дать рост в пит. среде. Любая бак. суспензия содерж. не- и жизнеспособные клетки. Методы: опред. общего числа бакт клеток и опред. жизнеспособных клеток. Определение общего числа клеток: 1) по стандарту мутности; 2) нефелометрический метод; 3) прямой подсчет клеток в счетных камерах (счетчики Коулдера – электронный счетчик). Число живых клеток: посев серийных разведений, исслед. суспензии: 1) посев на агар 1 мл – более точный; 2) посев на агар 0,1 мл, менее точный, т.к. часть бак. остается на шпапеле; 3) посев в тонком слое – 1 мл суспензии между 2-я слоями агара; 4) посев в многослойный агар; 5) метод мембранных фильтров (фильтр, обсемен. мк культ. на пит. среде). Методы определения массы. 1) прямые – отцентрифугир. биомассу и получить данные; - орпделение общего N2 или С или общего белка; 2) косвенные методы: по кол-ву израсходов. в-в сущ-т пропорциональная связь между кол-ом биомассы и рН средв; по растворенному О2.

Методы селекции мк и генная инженерия.

1. Поиск полезных (ценных) штаммов мк, появ. в природе самостоятельно путем естест. отбора. Они более приспособлены, более устойчивы к факторам внешней среды. Пользуются этими методами , когда искомый признак полезен для мк. Создают благоприятн. условия среды для этого мк, а потом естеств. отбор отбирает сам искомый признак: более приспособлен. форма вытесняет менне присп. форму (исходную); Искусственный отбор естеств. возникающих мутаций. Используют, если исходный фактор явл. неблагоприятн. или безразличным для мк, поэтому создать условия невозможно. Проводят планирование популяций, изучают отдельные клоны (культура из 1-й кл-ки генетич. однородна). Изолируют колонии на плотных питат. средах. Эффективна, если популяция гетерогенны (неоднородна). 2) Искусств. отбор с использованием мутагенных факторов. Мутагены – в-ва, увелич. частоту мутаций. Мутации направлены всеобразно (и + и -). Изменяем данный признак и подходящие варианты. Частота спонтанных мутаций 10^-6 10^-3, потом используют селективные среды. 3) Ступенчатая селекция с использованием мутагенов (селекция а/б) используя веерообразные мутации. Использование на различных мутагенов. 4) Селекция бакт. клеток путем получения ген. рекомбинаций (конъюгация, трансформ., трансдукц.). Следующие методы возникли в конце 70-х г. 5) Генная инженерия, работа с рекомбинантной ДНК. Возможна рекомб. только среди близкородств. мк. Это было раньше. Генная инженерия переносит ДНК в пределах всего живого, никаких барьеров нет. Все живое на молек. уровне устроено универсально: носитель наследственности – нукл. к-та - генетич. код – триплет, переносчик энергии – АТФ. Синтез макромолек. кл-к подчиняется 1-й закономерн.: для репликации, транскрипции., трансляции важным яв-ся послед-сть нуклеотидов в начале и оконч. процесса – сайт.

Схема генной инженерии.

1) получение фрагмента ДНК, кодир. необх. признаки (ген ДНК); 2) получение in vitro рекомб. молекулы ДНК из фрагментов ДНК, полученных на 1-м этапе и векторных молекул ДНК. Векторн. молекулы ДНК – это неh молекулы ДНК, способные самост. реплицироваться в кл-ке – реципиетны (плазмиды или фаговые ДНК). В рез-те объединения получ. рекомбинанты ДНК; 3) введение рекомб. ДНК в кл-реципиент; 4) клонирование.

Этапы работы: 1) источники и способы получения ДНК для клонирования: а – природная ДНК (нужный фрагмент ДНК – прямой источник); б – обратная транскрипция матричной РНК – пользуются, когда необходимо из эукариот в кл-ку прокариота внести информацию. Ген разделен на экзоны (кот. кодируют послед-сть амк), но они чередуются с некодир. областями - интронами (их роль неясна - у незрелой м-РНК). ДНК получают из РНК. Зрелая м-РНК без интронов идет на рибосомы. Синтезируется м-РНК (незрелая). Далее, когда интроны ликвидируют из м-РНК она станов. зрелой и способной к переносу инфекции; в - химико-ферментативный синтезом получ. ДНК. Расшифр. пос-сти амк или нуклеотид. посвлед. гена.; 2) получение рекомбин. ДНК in vitro (способы конструирования) – ДНК мк замкнутая кольцевая структураю ЕЕ необходимо разомкнуть, ее разрезают ферментом рестриктазой, кот. специфич. узнает нужные фрагменты. Более 500 различных рестриктаз. Липкое окончание, однонитьевое. Образование водородных связей через фосфатидные группы – отжит I этап – лигилирование - II (ДНК-лигаза). Самостоят. сборка на I этапе, выход рекомб. ДНК не очень большой. Исп. несколько рестриктаз, вероятность резко повыш., что нужный фрагмент останется. Самосборка только при наличие фосфатных групп. У векторных молекул фосфатные группы щелочной фосфатазой, чтобы она не самосоединялась; 3) введение рекомб. ДНК в кл-реципиент – плазмиды вводят трансформацией, кл-реципиенты поглощают свободую ДНК, поглощают 1 из 1000- 10000 рекомбинантн. ДНК. Фаговая ДНК вводится трансдукцией 1 из 10 рекомбинантных ДНК.; 4) Селекция клонирования – работа гена в чужой клетке называется экспрессия чужеродной генетической информации (///// - 1 \\\\\\ - 2 _______-3 - ген). 1 – сайт-промотор (сайт начала синтеза м-РНК) – с начала транскрипции узнает РНК-полимеразы, расплетает двойную цепь ДНК и начинает синтез матричной РНК.; 2- сайт – SD области – распознается рибосомами и начин. синтез белка; 3 – сайт терминатор (окончание процесса). У близкородствен. мк первые 2-а сайта близки и узнаются ферментами. Сайты яв-ся таксономическими барьерами. Вставляемый генг должен размещаться за промотором (т.е. синтез белка часто или постоянно). Слабые промоторы редко синтезируют белок. I. Возможно вставлять ген в среднюю часть, главное не нарушить рамку счатывания, нужно разрезать между триплетами, белок получается нечистым (р+д+р). Необходимо также чистый, негибридный белок, что не свегда получается; II. Получение гибридного SD-сайта: из SD-сайтов донора и рецептора. В каждом случае этот гибридный участок конструируется снова. Гибридный сайт трудно конструировать (SDр+SDд). Ген со своим терминатором получ. чистый белок. ; III. В ряде случаев терминатор одного гена яв-ся промотором для след. за ним гена. У гена, кот. переносят собственый промотор ликвидируется, а SD-обл. пееркрыв. на 1 нуклеотид с терминатором, т.е. вклинивается за терминатором. При создании промышленных штаммов мк добиваются не max экспрессии, а оптимизации процесса. Например, синтез а/б или органич. к-т – эти в-ва явл. ядовитыми для самой клетки. В таком случае прибегают к использованию регулируемых промоторов (t, pH). Накопили биомассу, включили промотор, накопили желаемое в-ва.

Рост бактерий в периодической культуре.

Периодической системой культивирования наз. с-му, в кот. после внесения бактерий (распаковки) в эту пит. среду не производится ни добавления, ни удаления каких-нить компонентов, кроме газовой фазы, при этом пит. среда из благопр. и даже оптимальной для роста мк превращ. в неблагоприятную, вплоть до полной остановки фазы размножения. (вверх – lg y, низ - t): I фаза - логфаза (адаптации) мк клетки адаптируются к пит. среде и к концу этой фазы мк начин. размножаться (лишь некоторые кл. 1,5 – 2 часа); II фаза – фаза логарифм. роста – все клетки в эту фазу размножаются. Удельная скорость роста (  максим. для данной культуры в данных условиях культивирования, период генерации – время между 2-мя последоват. делениями – постоянен и минимален). Суспензия состоит на 99,9% из живых клеток.; III фаза – ср. стационарного max  - фаза истощения пит. среды, накопления метаболитов, часть клеток начинает огтмирать. В какой-то момент скорость роста числа образ. клеток = числу отмираюшщих клеток.; IV фаза – средней логарифмической гибели. Параметры кривой роста и получение целевого продукта. Микробные метаболиты – принято называть продуктами синтеза I фазы (первичные метаболиты) или продукты синтеза II фазы (вторичн. метаболиты). Первичные метаболиты – продукты обр-ые мк в фазе lg роста: органич. к-ты, витамины. Вторичные – в фазу стационарного максимума: антибиотики, спирты, кетоны. Это деление условно. Б/т процесс должен пройти логарифмическую фазу культ. мк можно поддерживать некоторое t в лаб. для хранения необходимо закончить культивирование в конце фазы лог. роста. Для культ-ия необх. знать скорость роста и экономический коэф-нт – t.