Биотехнологии на основе изолированных протопластов

Гибридизация соматических клеток растений путем слияния изолирован­ных протопластов - еще один из способов создания генетического разнообразия для селекции. Преимущество этого метода - возможность переноса искомых ге­нов на далекие таксономические расстояния. Это особенно важно тогда, когда половое скрещивание невозможно, а методы in vitro, помогающие преодолеть прогамную или постгамную несовместимость, не помогают.

Получение соматических гибридов стало возможным после разработки приемов слияния изолированных протопластов и культивирования их на пита­тельных средах, дополненных осмотическими стабилизаторами.

В процессе культивирования изолированные протопласты и продукты их слияния образуют новую клеточную стенку, осуществляют ряд последователь­ных делений и превращаются в колонии каллусных клеток. Перенос на среду для регенерации индуцирует образование зачатков стеблей или эмбриоидов и закан­чивается регенерацией растений. Этап получения изолированных протопластов, благодаря существованию большого набора ферментных препаратов пектолитического и целлюлолитического действия, а также препаратов, активно разру­шающих гемицеллюлозу, не представляет особой сложности.

При изолировании протопластов применяют следующие растворы фер­ментных препаратов:

1). Из мезофилла листа табака: целлюлаза - 2,5%, пектиназа - 0,25%, ман­нит - 0,4 М.

2). Из мезофилла листьев и суспензионных культур картофеля: ксиланаза -2%, маннит - 0,3-0,4%.

3). Из каллусных тканей пшеницы: целлюлаза 1- 2%, пектинааза - 0,3%, СаС12 - 0,25 М (осмотик).

4). Из гипокотилей рапса: целлюлаза - 0,5%, мацерозим - 0.05%, маннит -0,4 М.

Для подготовки листьев пробирочных растений к инкубации в растворе ферментов удаляют нижний эпидермис или разрезают их па полоски шириной 0,5-1 мм (желательно в растворе плазмолитика). Затем листья помещают на поверхность раствора ферментов и плазмолитика и инкубируют в растворе ферментов (время, температуру и рН буфера или среды подбирают эмпирически).

При использовании меристемных тканей при выделении протопластов, в небольшом числе происходит спонтанное слияние протопластов.

Для индуцированного слияния изолированных протопластов с целью гиб­ридизации соматических клеток используют следующие методы:

1). Добавление в среду инкубации изолированных протопластов ве­ществ, стимулирующих слияние. Например, добавляют нитраты (NaNO3), по­лиэтиленгликоль (ПЭГ), среду с высоким рН и высокой концентрацией ионов кальция.

2). Методика Као (1976).

- Пастеровской пипеткой суспензии протопластов (0,1 мл) переносят на покровное стекло, помещенное в чашку Петри (60 х 15 мм).

- Через 5 мин (после того, как протопласты осядут на дно капли), осторожно добавляют маленькими каплями 0,45 мл раствора полиэтиленгликоля в концентрации 40%.

- Инкубируют при комнатной температуре в течение 15-30 мин.

- Осторожно добавляют в течение 10 мин 0,5 мл питательной среды, в ко-] торой будут культивироваться протопласты.

- Промывают протопласты 5 раз добавлением свежей питательной среды с интервалом 5 минут между добавлениями. Перед добавлением свежей порции на покровном стекле оставляют тонкий слой старой среды, чтобы не подсушить] протопласты.

3). Слияние с помощью электрического тока.

Метод электрослияния изолированных протопластов основан на применении неоднородного электрического поля, создаваемого переменным током с напряжением 100 В и частотой 50 Гц в камере, куда помещают изолированные протопласты и вводят платиновые электроды. В этих условиях наблюдается диэлектрофорез, и протопласты выстраиваются в цепочку между электродами. Для слияния используют сильный импульс постоянного тока 1,2 кВ/см в течение 50 МКС.

Техника получения изолированных протопластов разработана для многих растений. Культивирование и получение на их основе проще удается для представителей семейства пасленовых, капустных, зонтичных, рутовых и некоторых других, труднее для злаков и бобовых. И здесь уже есть успехи: из протопластов риса, изолированных из каллусной ткани, возникшей из микроспоры, удалось получить колонии. В четырех из них наблюдали развитие корней и стеблевых зачатков, из которых один образовал проросток.

Получены зародыши и проростки в клеточной суспензии, возникшей из протопластов африканского проса. Исследователям фирмы Мицубиши в Японии удалось получить растение - соматический гибрид путем слияния протопластов риса и проса.

Гибридизация соматических клеток методом слияния протопластов, безсомнения, обогатила клеточную биологию. Появилась возможность изучать по ведение гибридных ядерных геномов при разной степени таксономической удаленности партнеров. Межродовая соматическая гибридизация между картофе лем (Solanum tuberosum) и томатом (Lycopersicon esculentum) позволила получить гибридные растения двух типов, которые авторы назвали «топато» и «помато» в зависимости от родовой характеристики хлоропластов гибрида. В пер­вом случае хлоропласта были томатные, во втором - картофельные. Эти расте­ния не обладали хозяйственно полезными свойствами, но позволили наблюдать проявление признаков партнеров и сочетание их на морфологическом и биохи­мическом (синтез алкалоидов) уровнях.

Анализ перспектив отдаленной соматической гибридизации, результатом которой является получение растений с гибридным ядерным геномом для прак­тической селекции далеко не так оптимистичен. Удалось получить только меж­видовые, а не отдаленные гибриды.

При межвидовой соматической гибридизации могут возникнуть как сте­рильные, так и фертильные растения. В последнем случае есть возможность по­лучить потомство от самоопыления или обратного скрещивания с культурными сортами. Последнее важно, так как часто у гибридов (например, между сортами картофеля и дикими видами) преобладают признаки диких видов.

Принципиальное отличие соматических гибридов, полученных методом слияния протопластов, от гибридов, полученных половым путем, состоит в том, что в большинстве случаев при половом скрещивании цитоплазматические гены передаются только материнским путем, при соматической гибридизации - от обоих родителей.

Сегрегация ядер соматических гибридов, слияние изолированного прото­пласта с цитопластом, лишенным ядра, слияние протопласта-реципиента с энуклеированным протопластом или протопластом, ядро которого инактивировано облучением и не способно к делению, приводит к получению так называемых цибридов. Цибридизация - способ введения важных цитоплазматических генов, несущих такие признаки, как ЦМС, устойчивость к некоторым гербицидам и па­тогенам, в изолированный протопласт растения с интересующим селекционера генотипом.

В литературе есть сведения о переносе этим способом гена устойчивости к гербециду триазину, кодирующего синтез белка мембраны хлоропластов с моле­кулярной массой 32 000 Д, от устойчивого растения паслена черного картофелю. Может представлять интерес использование цибридизации для переноса гена ус­тойчивости к тентотоксину (Alternaria solanii) от табака картофелю, а также других цитоплазматических генов, определяющих устойчивость. При переносах цитоплазматических генов, кроме метода слияния изолированных протопласта-реципиента с цитопластом или протопластом с инактивированным ядром, можно использовать и другие методы введения их: микроинъекцию и перенос с помощью липосом.

Методы и условия манипуляций с клеткой, которые можно назвать собст­венно клеточной инженерией растений, еще только разрабатываются биотехно­логами, последствия их в большинстве случаев не изучены.

Медленный рост (время удвоения числа клеток 1-3 дня), длительный пе­риод выращивания (2-3 недели) в строго асептических условиях, чувствитель­ность к механическим повреждениям, во многих случаях низкое содержание ис­комого продукта являются недостатками метода культивирования каллусных культур, ограничивающими его применение в промышленности.