
- •План реферата
- •Введение
- •Сохранение in vitro генофонда. Коллекции и банки
- •Получение безвирусного посадочного материала
- •Каллусогенез как основа создания клеточных культур
- •Длительно выращиваемые культуры
- •Культивирование отдельных клеток
- •Биотехнологии на основе изолированных протопластов
- •Обзор литературы
Культивирование отдельных клеток
Источниками отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений (например, мезофилла листа), изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки.
Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость при выращивании клонового материала. Для создания технологий важно изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у отдельных клеток, изолированных от влияния других клеток популяции и тканей.
Изолированные из тканей растения или протопласты культивируемых клеток после образования клеточной стенки являются идеальными отдельными клетками.
Отдельные клетки могут быть изолированы из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра с сортером или путем последовательных разбавлений. Для использования последнего метода суспензия готовится разными способами:
1). 1-2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток.
2).
Суспензию фильтруют через фильтры с
уменьшающимся размером пор (нейлоновые
сетки или металлические фильтры). Для
последовательных разбавлений
используют платы для . микротитрований.
Это позволяет микроскопически
контролировать клеточный состав при
последовательных разбавлениях.
Индукция делений отдельных клеток из
суспензии, изолированных протопластов,
отдельных или высеянных при очень низкой
плотности клеток, полученных методом
последовательных разбавлений, возможна
при использовании очень богатой
питательной среды, например среды
Рис. 2. Использование «няньки» - культуры суспензионных клеток при выращивании изолированных протопластов и одиночных клеток кукурузы: 1 - фольга; 2 - колба Эрленмейера; 3 - колонии клеток; 4 - фильтровальная бумага; 5 - алюминиевая сетка; 6 - пенополиуретан; 7 - суспензия клеток
Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен быть минимальным (микрокапли в чашке Купрака объемом 20 мкл). Даже и при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается низким. Более эффективны методы использования ткани-«няньки» или «кормящего слоя».
Для создания «кормящего слоя» используют суспензию клеток того же вида растения, что и одиночная клетка, или близкого вида (рис. 2). Клеточная суспензия берется в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. Каллусная культура, служащая тканью-«нянькой», также должна быть в состоянии активного роста. При достижении колонией, возникающей из отдельной клетки, величины 0,5-1 мм клон может быть перенесен для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно или на фильтр, помещенный на поверхность агара. Использование «кормящего слоя», ткани-«няньки» и минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связано с феноменом, носящим название «действие фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные попытки определить химическую природу веществ (или вещества), индуцирующих деление отдельной клетки, и раскрыть механизм действия фактора кондиционирования, ясности здесь пока нет. Уверенно можно сказать, что это фактор химической, а не физической природы, термостабилен, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами.