Длительно выращиваемые культуры

Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом либо на полутвердой агаризованной среде (концентрация агар-агара 0,6-1,0 %) или среде с применением других желирующих полимеров, либо на мостиках из фильтровальной бумаги или на дисках из пенополиуретана, полупогруженных в жидкую питательную среду.

Основные компоненты питательных сред для культуры тканей и клеток растений - минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки. Это мо­гут быть эндоспермы: кокосовых орехов в концентрации 7-20%, конского каш­тана - 5-15, а также березовый сок - 10-20, экстракты из органов вегетирующего растения - 0,1-1, томатный сок - 5-10. Солодовый экстракт - 5-10, дрожжевой экстракт - 0,1-0,2, гидролизат казеина - 0,02-0.1%, смесь аминокислот, дрожже­вой экстракт, экстракты из разных органов растений. Начиная работать с новым объектом, авторы модифицируют состав стандартных сред, особенно часто из­меняя концентрацию и набор органических компонентов. Оптимизацию состава среды целесообразно проводить с применением методов математического пла­нирования эксперимента.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным Способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы каллусной ткани может быть белым, желтоватым, зеленым, красноватым, бурым, пигментированным полностью или зонально присутствием хлорофилла и антоцианов.

В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные тка­ни бывают: 1) рыхлыми, сильно обводненными, легко распадающимися на от­дельные клетки; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематиче­скими очагами; 3) плотными, с зонами редуцированного камбия и сосудов (в основном, трахеидоподобных элементов).

Обычно, в длительной пересадочной культуре на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина - 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рых­лыми.

В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, они приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и, наконец, деградируют.

На рисунке 1 представлен ростовой цикл популяции культивируемых клеток при поверхностном и глубинном периодическом выращивании. Субкультивирование рекомендуется проводить, используя трансплант или инокулюм из фаз замедления роста или ранней стационарной предыдущего цикла выращива­ния.

Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Ростовая кривая (модельная) имеет S-образную форму. На ней различают (рис. 1) латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулюма не наблюдается ни по одному из критериев (1); экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с ускорением (2); линейную, в которой скорость роста постоянна (3); фазу замедленного роста (4), стационарную фазу (5) и фазу деградации клеток (6). Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Это зависит как от генетиче­ской характеристики популяции (вида растения), так и от количества инокулюма и условий выращивания.

Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных продуктов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает макси­мума в стационарной фазе. Исключение составляет фаза биосинтеза некоторых алкалоидов, которая совпадает по времени с фазой максимальной митотической активности или экспоненциальным ростом Чаще механизм и условия, блоки­рующие клеточную пролиферацию и активный рост, являются одновременно механизмами активации ферментов вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут стимулировать переход к синтезу вторичных продуктов и увеличить их выход.

Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто приме­няют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий мутантов, из них получают суспензии клеток, растущих в жидкой питательной среде. Как правило, для регенерации растений предпочитают также каллусные ткани.

Культуры клеток растений, вы­ращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензион­ными культурами.

Отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные агре­гаты (более 50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии в жидкой среде. Применяют различные аппараты и способы поддержания их в таком со­стоянии. Начальный момент получения суспензионной клеточной культуры является событием рандомическим. Это означает, что только клетки, кото­рые по ряду причин способны к перестройке метаболизма, и делятся с вы­соким коэффициентом в данных кон-Рис. 7. Модельная кривая роста в конкретных условиях суспензионного цикле периодического выращивания культивирования, образуют «хорошие линии». Оптимальные характеристики таких линий: высокая степень дезагре­гации (5-10 клеток в группе), морфоло­гическая выравненность клеток (не­большие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплаз­ма), отсутствие трахеидоподобных элементов.

Обычным способом получения клеточной суспензии является перенос каллусной ткани в жидкую питательную среду в колбу, которая затем помещает­ся на качалку, или в специальные сосудики, перемешивание суспензии в кото­рых производится с помощью роллеров разного типа. Инициация суспензионной культуры требует 2-3 г свежей массы каллусной ткани на 60-100 мл жидкой пи­тательной среды. Скорость перемешивания для получения первичной суспензии на круговой качалке - 100-120 об/мин. Суспензионную культуру можно полу­чить и прямо из фрагмента органа растения диски запасающей паренхимы мя­систых корней моркови, петрушки, клубней картофеля и др., однако такой путь более трудный и длительный. Клетки экспланта должны образовать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жид­кую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в сус­пензии.

Рыхлые обводненные культуры каллусных тканей более пригодны для пе­ревода в суспензию, чем структурированные, плотные каллусы. Выращивание каллусов на среде с 2,4-Д, исключение из среды ионов Са++ ,обработка пектина­зой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре, увеличивает шансы на успех. Первичную суспензию перед субкультивировани­ем фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных, плотных кусков каллусной ткани (или остатков эксплан­та) и очень крупных агрегатов.

Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма, исчезновение одних и появление других стойких эпигенетических изменений, передающихся в. ряду клеточных поколений, адаптивный отбор, идущий в популяциях, приводят к возникновению из первичной каллусной тка­ни генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Получение сус­пензии, обогащенной отдельными клетками и их небольшими группами, облег­чает выделение линий, маркированных но определенным признакам, а также от­бор мутантов и вариантов на селективных средах.