Каллусогенез как основа создания клеточных культур

Важные для сельского хозяйства технологии in vitro разработаны с использованием объектов разной сложности организации, начиная с изолированных протопластов, и кончая изолированными завязями или зародышами. Однако культивируемые клетки играют при этом центральную роль, выступая либо не посредственным объектом генетических манипуляций, либо обязательным этапом создаваемых на основе других объектов технологий.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Реже культивируют клетки опухолей растений разного происхождения. Культуры опухолевых клеток как при поверхностном, так и при глубинном вы­ращивании, мало отличаются внешне от культур каллусных клеток, даже на уровне морфологии клеток. Значительным физиологическим различием между ними служит гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им де­литься и расти на питательных средах без добавок стимуляторов роста. Опухо­левые клетки лишены также способности давать начало нормальным организованным структурам - корням или побегам в процессе органогенеза и эмбриоидам в процессе соматического эмбриогенеза. В некоторых случаях они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), которые дальше не могут развиваться нормально. Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести способность к росту на среде без стимуляторов роста. Природа такой независимости к одному или обоим стимуляторам (ауксину и цитокинину), обычно применяемым при получении и выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих независимость клетки от экзогенных стимуляторов).

При генетической независимости каллусные клетки ведут себя так же, как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак зависимости в ряду пре­вращений клетка—> растение—> клетка, что и является доказательством негенетической природы такой приобретенной независимости от присутствия в среде стимуляторов роста.

Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возни­кающей в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функцио­нирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, на­капливает питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей раз­ных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную пита­тельную среду в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержания пересадочной культуры требуют абсолютной асептики. Для этого с помощью различных стерилизующих растворов, содержащих чаще всего активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты.

После инкубации в стерилизующем растворе материал промывают в трех порциях стерилизованной воды, по 10 минут в каждой. Прописи стерилизации разных объектов даны в таблице 1. Стерилизуют в автоклаве или фильтровани­ем через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при давлении 0,15 мм рт. ст. в течение 60 мин или сухим паром в шкафах при температуре 160°С сте­рилизуют посуду, инструменты, материалы, необходимые для работы. Манипу­ляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облучаемых перед работой ультрафиолетом или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем.

Таблица 1

Стерилизация исходного растительного материала

Объекты	Время стерилизации, в минутах
	Диацид 0,1 %	Сулема 0,1 %	Гипохлориты Na, Ca, 5-9 %	Перекись водо­рода 10-12 %
Семена сухие	15-20	10-15	15-20	12-15
Семена набух­шие	6-10	6-8	10-15	6-8
Ткани мясистого корня, клубни	20-30	15-25	15-20	-
Ткани стебля	20-40	20-25	20-25	-
Листья	1-3	0,5-3	3-6	3-5
Апексы	1-10	0,5-7	3-15	2-7

Особенности дедифференцировки клеток экспланта и каллусогенеза зави­сят от эпигенетических характеристик составляющих его тканей. Клетки тканей запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла листа и других специализи­рованных тканей, эксплантированных в питательную среду, содержащие мине­ральные соли, источники углерода, витамины и стимуляторы роста, должны дедифференцироваться, т.е. потерять структуры, характерные для их специфиче­ских функций в растении, и вернуться к состоянию делящейся клетки.

Часто эксплант используемый для получения каллуса, является фрагмен­том органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. На­пример, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клетки эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбия и сосудистой системы, сердце­винной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от раз­личий в физиологическом состоянии исходного растения можно наблюдать пре­имущественную пролиферацию клеток либо камбия и его молодых дериватов, либо коры, либо сердцевинной паренхимы.

Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, т.к. некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток переда­ются в ряду клеточных поколений как стойкие, эпигенетически наследуемые признаки. В клетках экспланта в самом начале культивирования могут наблю­даться изменения в метаболизме, связанные с травматическими синтезами, с де­дифференцировкой и подготовкой к процессу деления. Между этими процесса­ми может существовать причинно-следственная связь, механизм которой точно не известен.

Можно предположить, что травма приводит к высвобождению из клеток биологически активных веществ - индукторов или элиситоров клеточных делений, отличающихся по своей природе от стимуляторов роста растений (аук­синов, цитокининов, гиббереллинов). В роли элиситоров могут выступать про­дукты разрушения полисахаридов клеточной стенки. Их действием можно объ­яснить и быструю дедифференцировку специализированной клетки, приводящую к метаболизации веществ запаса, перестройке пластидного аппарата, уве­личению структур, связанных с синтезом белков.

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ядерной ДНК, исчезают тканеспецифичные белки анти­гены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке.

Образование каллуса не во всех случаях связано с поверхностью эксплан­та. Каллус может образоваться в результате пролиферации внутренних тканей без связи с поверхностью среза. Развивающийся каллус разрывает слой ткани и обычно выходит на поверхность. Ярким примером образования каллуса, не свя­занного с травмой, служит каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолиро­ванного пыльника. Каллусогенез при эксплантировании фрагмента ткани в усло­виях in vitro свойственен не только покрытосеменным, но и голосеменным рас­тениям, папоротникам, мхам, печеночникам.

Первичный каллус, образовавшийся на эксплантах, через 4-6 недель (в за­висимости от темпов роста) переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Масса трансплантанта (переносимого кусочка) при культиви­ровании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг ткани на 20-40 мл питательной среды.

Техника культивирования тканей растений позволяет в настоящее время получить длительную пересадочную каллусную культуру из любых живых тка­невых клеток интактного растения. Различно дифференцированные клетки (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу де дифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфиче­ские функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус. В процес­се субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуаль­ными генетическими и физиологическими особенностями.