Сохранение in vitro генофонда. Коллекции и банки

Технология сохранения в культуре in vitro генофонда, используемого в селекции, или в виде растущих коллекций (периодически субкультивируемых про­бирочных растений, оздоровленных методом культуры меристем) или в виде клеточных и меристемных коллекций, хранящихся после глубокого замораживания в криобанках, в жидком азоте (температура - 196°С). Цель коллекций и бан­ков - обеспечить селекционера в любое время генотипом, несущим искомые при­знаки, нужные для его работы.

Растущие коллекции видов и сортов, применяют для сохранения генофонда не только растений, размножающихся вегетативно, но и размножаемых семе­нами. Последнее важно для поддержания маркированных изогенных линий, ли­ний с ЦМС, гетерозисных гибридов, уникальных генотипов, свойства которых будут потеряны при половом размножении.

Периодическое субкультивирование трудоемко и удорожает технологию. Период без пересадок (субклонирования) можно удлинить до 6-24 месяцев, поместив коллекции в условия низких положительных температур (1-10°С) при ин­тенсивности освещения 4000-5000 лк. Выбор температуры определяется холодо­стойкостью вида растения. Так, для депонирования коллекций картофеля использовалась температура 10 °С, яблони – 1 °С. Рост растений можно также задержать добавлением к питательной среде осмотиков - маннита и сорбита, повышением концентрации сахарозы или внесением в питательную среду веществ, тормозящих рост. В качестве последних были использованы гидразид малеиновой кислоты, 2,2-метил-гидразид янтарной кислоты, абсцизовая кислота. В по­следнее время для замедления роста коллекций начали применять такие методы, как снижение атмосферного давления (до 0,04 мм рт. ст.) и гипоксия. Условия гипоксии создают, применяя смесь 90% азота и 10% кислорода. Иногда комби­нируют эти два фактора, снижая концентрацию кислорода и одновременно уменьшая атмосферное давление. В результате рост растений хризантем по чис­лу междоузлий снижался в 3 раза в сравнении с контролем за период выращива­ния 6 недель.

Дополнительное достоинство сохранения генотипов в виде коллекций in vitro - возможность разместить на 1м² площади в камере для культивирования более тысячи пробирок с растениями.

Криосохранение генофонда растительного материала в жидком азоте - бо­лее совершенный метод, в сравнении с описанным выше. Он гарантирует ста­бильное сохранение генетических характеристик объектов практически в течение любого срока. Его можно применять для сохранения генофонда более широ­кого диапазона объектов - от изолированных протопластов до зародышей и се­мян Хорошо организованная работа криобанка менее трудоемка, чем поддержа­ние и депонирование растущих коллекций. Метод позволяет сохранить без из­менений мутантные, гибридные, трансформированные, способные к морфогене­зу клетки разных видов растений, меристемы и кончики побегов, зиготические и соматические зародыши, пыльцу, семена, в том числе не выносящие обезвожи­вания.

В настоящее время разработаны условия криосохранения более чем для 30 видов - с целью культивирования клеток, 10 видов - для каллусных культур, 8 видов - для изолированных протопластов, 13 видов - для сохранения меристем и кончиков стебля. Метод замораживания и хранения в жидком азоте меристем разработан для следующих растений: Arachis hypogea, Brassica napus, Cicer arietinum, Dianthus cariophyllus, Diqitalis lanata, Fragaria ananassa, Lycopersi-con esculentum, Mains domestica, Manihot esculenta, Pisum sativum, Solanum tuberosum, S.goniocalyx, S.chacoense.

В криобанке Института физиологии растений РАН наиболее старая из хранящихся клеток культура моркови находится в жидком азоте уже более 10 лет.

Наиболее проста техника Криосохранения пыльцы. Подсушенную пыльцу помещают в запечатанные пластмассовые ампулы, используемые при хранении, и прямо переносят в жидкий азот. Пыльца пяти испытанных сортов картофеля, размороженная после 1,2, и 3 лет хранения в жидком азоте, имела высокую жиз­неспособность, фертильность и была эффективно использована в скрещиваниях. Криобанк пыльцы делает возможным скрещивание сортов, различающихся по времени цветения, характеризующихся кратковременностью фазы сохранения пыльцой фертильности или вариабельностью ее свойств под влиянием неблаго­приятных условий.

Значительно более сложна технология Криосохранения культивируемых клеток, изолированных меристем, кончиков побегов, зародышей. Трудности свя­заны с необходимостью защитить замораживаемые клетки и ткани от соматиче­ского стресса и механического разрушения культур в результате образования и роста кристаллов льда, а также обеспечить жизнеспособность их при оттаивании и рекультивации.

Общие приемы технологии Криосохранения. Это применение криопротекторов и предобработка клеток перед замораживанием, соблюдение определенно­го режима замораживания в интервале от 0 до - 40 °С, специальные предосто­рожности при оттаивании и рекультивировании объектов.

Криопротекторы - это вещества, которые на этапе замораживания должны уменьшить повреждения клеток от осмотического и механического стресса. Их отбирают по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Это либо проникающие в клетки вещества - диметилсульфоксид (ДМСО) и глице­рин, либо непроникающие высокомолекулярные - поливинил пиролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Концентрацию и время действия оптимизируют эмпи­рически в зависимости от объекта.

ДМСО - криопротектор, наиболее часто используемый в чистом виде или с добавлением других веществ, например, сахарозы, глицерина, применяют в концентрации 5-10%, глицерин в концентрации 10-20%. Помогает защитить клетки от стрессов замораживания также предобработка их осмотически актив­ными веществами - маннитом, пролином и некоторым другими аминокислотами, добавленными к питательной среде.

Большое значение для успеха Криосохранения имеет режим заморажива­ния на этапе от 0 до - 40 0С, который может быть медленными, со скоростью 0,5-1°С в минуту ли сверхбыстрым (непосредственное погружение в жидкий азот объекта размером до 0,5 мм). Замораживание в медленном режиме дает более успешные результаты. Программные замораживатели разработаны и произво­дятся в Институте криобиологии АН Украины. Оттаивание и восстановление часто является критическим этапом процесса.

Криобанки предоставляют возможность селекционерам широко использо­вать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов. Можно со­хранять без генетических изменений уникальные гибридные, мутантные и трансформированные линии. Криобанки могут сохранить пул генов исчезающих видов растений.