2.4. Методи аналізу днк.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) відноситься до найпоширеніших та високотехнічних методів детек­ції і на сьогодні є основним методом аналізу рослинного матеріалу на наявність генетично модифікованих інгредієнтів. За допомогою ПЛР можна детектувати будь-яку частину впровадженої генетичної конструкції: промотор, структурний ген, термінатор або репортерний ген. ПЛР можна використовувати для рутинного скринінгу ГМО, оскільки відомо, що у більшості конструкцій, які застосову­вали для генетичної трансформації рослин, присутні або 35S про­мотор вірусу мозаїки цвітної капусти, або елемент регуляції транс­крипції (термінатор) гена нопалінсинтетази з А. tumefaciens (pNOS i tNOS).

Проведення ПЛР аналізу з праймерами до згаданого промотора та термінатора дозволяє детектувати переважну більшість трансгенних рослин. Ідентифікація ГМ рослин потребує повної інформації про структуру впровадженої генетичної конструкції та її аналізу. Аналіз матеріалу на наявність генетичних модифікацій за допомогою цього методу поділяється на кілька етапів:

1. Детекція, загальне визначення присутності ГМО в зразках.

2. При наявності позитивного результату наступний етап включає оцінку типу впровадженої генетичної конструкції та, відповідно, визначення наявності дозволу на реалізацію даного типу генетично модифікованих організмів.

3. Кількісне визначення ГМ організмів.

На першому етапі ПЛР відбувається теплова денатурація ДНК при 93-95°С протягом 1 хв. Крім матриці ДНК суміш містить у надлишку пару праймерів, Таq-полімеразу та чоти­ри дезоксирибонуклеотиди. Температуру суміші повільно знижу­ють, до 55°С, що призводить до зв'язування праймерів з компле­ментарними послідовностями ДНК. Після цього температуру сумі­ші підвищують до 75°С, величини, оптимальної для Таq-полімерази. Починається синтез комплементарного ланцюга ДНК що ініціюється 3'-гідроксильною групою праймера. Внаслідок багаторазового повторення цих трьох етапів відбувається синтез конкретного сегмента ДНК.

Коли кількість копій ділянки аналізованої ДНК становить мі­льйон та більше, їх можна аналізувати із застосуванням фізичних методів з УФ або флуоресцентним детектуванням. Інформація про наявність ГМО у зразках отримують визначенням присутності або відсутності конкретного амплікону після проведення гель-електрофорезу продуктів НЛР.

Рис. 3. Схема синтезу конкретного сегмента ДНК методо ПЛР

2.5. Real-time ПЛР

Найпоширенішим методом кількісної оцінки ГМО є метод полімеразної ланцюгової реакції в умовах реального часу (real-time ПЛР) - методика, що базується на постійному моніторингу продуктів ампліфікації. Даний варіант ПЛР дозволяє проводити коректну оцінку нуклеотидного матеріалу (кількість копій геномних еквівалентів вихідної матриці) в будь-який момент часу протягом всього процесу проведення ПЛР аналізу.

Використання методики real-time ПЛР дозволяє:

1. Визначати вихід продукту реакції після кожного циклу ампліфкацїї.

2. Конструювати згідно з отриманими даними кінетичну криву ПЛР.

3. Визначати відносну концентрацію субстрату на основі аналізу цієї кривої.

Для детекції продуктів ампліфікації використовують флуорес­центні барвники, які забезпечують флуоресценцію, прямо пропор­ційну кількості ПЛР- продукту.

Рис. 4. Принципова схема проведення експерименту з real-time ПЛР