Розділ 2. Виявлення та визначення генетично модифікованих матеріалів у харчовій продукції

2.1. Загальна характеристика методів аналізу гмо

Виявлення модифікованих об'єктів (ГМО) у рослинній сирови­ні, продуктах харчування, тваринних кормах та постреєстрацйний моніторинг трансгенних організмів потребує розробки надійних методів детектування, ідентифікації та кількісного аналізу ГМ продукції. Розвиток та стандартизація методів виявлення ГМО в експериментальних зразках рослинного або тваринного походжен­ня необхідні для визначення та реалізації правил маркування про­дукції такого типу. Сучасний розвиток ГМ-технологій та стандар­тизація методів контролю ГМО потребують безпомилкового визна­чення в експериментальному матеріалі присутності дуже малої кількості трансгенних ДНК.

Ідентифікація ГМО теоретично може здійснюватися за різними критеріями: оцінка за фенотиповими ознаками, визначення специ­фічних РНК, аналіз синтезованих білків та метаболітів або безпосе­реднє детектування вбудованих трансгенних конструкцій на молекулярному рівні. Методи детекції ГМО повинні відповідати насту­пним критеріям:

1. Можливість детекції різних видів ГМО.

2. Забезпечення кількісної інформації про наявність ГМ-матеріалу в біологічному об'єкті.

3. Наявність інформативних результатів, які охоплюють ши­роке коло продуктів харчування та сільськогосподарської продукції.

4. Забезпечення максимально коректної оцінки результатів.

5. Забезпечення чутливості та відтворюваності результатів аналізу.

Серед поширених методів ідентифікації ГМ рослин можна ви­ділити біологічні методи оцінки та аналізу фенотипів ГМ рослин; методи, що базуються на визначенні специфічних білків, синтезо­ваних трансформованими рослинами та методи аналізу ДНК на наявність елементів привнесеної генетичної конструкції.

2.2. Методи аналізу фенотипу

Методи аналізу фенотипу відно­сяться до «низькотехнологічних» засобів та дозволяють виявити наявність специфічних ознак в ГМ рослинах (у більшості випадків - це стійкість або толерантність до гербіцидів). Проведення таких тестів включає оцінку здатності рослини до росту після обробки специфічним гербіцидом.

2.3. Методи визначення специфічних білків, синтезованих трансформованими рослинами (імунодіагностика)

Принцип методу полягає у детекції нових білків, які утворюються внаслідок генетичних модифікацій рослин, основою якого є ідентифікація комплексу антиген-антитіло. Цей спосіб детекції є специфічним і потребує відносно простого підготовчого етапу для аналізованих зразків. Для ефективної оцінки присутності молекули-мішені (в даному випадку - білку ГМ організму) в експериментальному зразку необхідно забезпечити умови виключення блокування сайту зв'язування антигену з антитілом (відсутність у зразку фенольних компонентів, жирних кислот та ендогенних ферментів, що кон'юговані з антитілом). Ефективність проведення аналізу також залежить від характеристик антигена (величини гідрофобності та третинної структури).

Найбільш розповсюдженим типом імунодіагностики є Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Цей метод дозволяє виявляти білки, які є типовими для існуючих сьогодні ГМ рослин, зокрема, EPSPS, Bt, Cry 1 Ab та PAT.

Імуносорбентний аналіз (ELISA) проводять у кілька етапів. На поверхню твердої підложки (наприклад, пластикової плаш­ки для мікробіологічного титрування) наносять специфічні антитіла та додають антиген (розчин, що містить білок-мішень). Після цього промивають лунку для вимивання компонентів, які не зв'язались, та додають другі антитіла, специфічні до антигенної складової білка-мішені. Другі антитіла попередньо кон'югують з ферментом для подальшого проведення ферментативної реакції з утворенням забарвленого продукту. Таким ферментом найчастіше є пероксидаза хріну чи кисла фосфатаза. Після проминання в лунку додають субстрат для ферменту, що каталізує перетворення незабарвленого субстрату в забарвлений продукт реакції, кількість якого пропорційна концентрації зразка. Кількісну або якісну оцінку проводять спектрофотометрично.

Рис. 1. Загальна схема постановки імуносорбентного аналізу

Антитіла можуть бути поліклональними (отримують з сироватки крові імунізованих тварин), які зв'язуються з різними антиген­ними детермінантами молекули-мішені, та моноклональними (отримують з клітинних культур), які є специфічними до однієї антигенної детермінанти.

Однією з різновидностей тесту ELISA є детекція ГМО у лист­ках чи насінні рослин за допомогою індикаторних смужок. Прин­цип методу полягає в тому, що на мембрану смужки нанесені анти­тіла з високим ступенем спорідненості до відповідного епітопу молекули антигена. Мембрана містить дві зони зв'язування: одна для чужорідного білка, інша для кольорового реагенту. Після зану­рення смужки у розчин з екстрактом зразка, який містить чужорід­ний білок, відбувається зв'язування більшої частини антитіл з антигеном; частина з антитіл залишається зв'язаною виключно з кольоровим реагентом.

Рис. 2. Принцип детекції ГМО за допомогою індикаторних смужок

Наявність однієї лінії після проведення аналізу свідчить про негативний результат, а наявність двох - про позитивний. Метод є досить ефективним та дає 90%-ний результат при наявності у зраз­ках не менше 0,15% ГМО.