4. Система протеина с.

Образование и структурные особенности протеина С

Протеин С(РС) – один из факторов протромбинового комплекса, профермент активированного протеина С (АРС), природного антикоагулянта, прерывающего процесс тромбиногенеза. Структура имеет высокую степень гомологии с прокоагулянтными факторами VII, IX и X.

Впервые ингибитор образования тромбина из протромбинового комплекса крови, названный аутопротромбин II-A, был открыт в 1960г в лаборатории Сигерса (США). В 1969г ингибитор был получен из продуктов протеолиза тромбином белков протромбинового комплекса в лаборатории биохимии и физиологии свертывания крови МГУ (Баскова, Струкова). В 1976 году Дж.Стенфло выделил, очистил ингибитор из плазмы быка и назвал его протеином С, поскольку при хроматографии протромбинового комплекса фракция белка с ингибиторной активностью элюировалась третьей по счету, после прокоагулянтных факторов X и протромбина.

Протеин С синтезируется в печени в форме одноцепочечной молекулы, как все витамин К-зависимые белки. Кроме того, РС обнаружен в почках, яичках, эндотелии сосудов, кератиноцитах кожи человека, а также мозге и легких.

Профермент состоит из нескольких доменов: аминоконцевого (NH2) отрицательно заряженного; двух доменов, подобных эпидермальному фактору роста (EGF); связывающего дипептида ( Lys156-Arg157); пептида активации и трипсиноподобного протеазного (SP) домена на карбоксильном(СООН) конце молекулы (Табл РИС ). В результате посттрансляционной модификации молекулы происходят следующие изменения структуры профермента:1) выщепление связывающего дипептида Lys156-Arg157 и превращение одно-цепочечной формы в двух цепочечную молекулу, состоящую из тяжелой и легкой цепей, соединенных дисульфидной связью; 2) дополнительное γ - карбоксилирование девяти остатков глутаминовой кислоты NH2 конца легкой цепи РС и образование Гла-домена; 3) гидроксилирование остатка Asp в EGF1 домене; 4) гликозилирование.

Кроме Гла-домена, легкая цепь протеина С содержит два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF1 и EGF2 домены) (Табл. 3).

Тяжелая цепь протеина С содержит короткий отрицательно заряженный пептид активации Lys158-Arg169 и домен сериновой протеиназы (SP).

Рис. 4. Cтруктура протеина C

6.2. Активация

Протеин С циркулирует в крови в форме профермента. Превращение профермента РС в сериновую протеиназу- активированный протеин С (АРС) происходит вследствие расщепления тромбином одной пептидной связи Arg169 - Leu170 в тяжелой цепи протеина С человека и освобождения отрицательно заряженного 12-членного пептида активации (Lys158-Arg169). При активации РС быка отщепляется 14-членный пептид.

На поверхности эндотелия сосудов тромбин, образуемый в низкой (нМ) концентрации на стадии инициации свертывания крови, связывается со своим высокоаффинным рецептором тромбомодулином (ТМ). Тромбин в комплексе с ТМ активирует расщепление РС, связанного со своим специфическим рецептором -EPCR (эндотелиальным рецептором протеина С ), в сериновую протеиназу – активированный протеин С (АРС) (Рис. 6)

ТМ- первая мишень тромбина на эндотелии. Для сравнения, константа связывания тромбина со специфическим субстратом – фибриногеном, на три порядка выше. При связывании с ТМ изменяется конформация тромбина и повышается сродство фермента к субстрату - протеину С. Связывание тромбина через анион – связывающий сайт 1 (ABE1) с ТМ ускоряет в 100 раз активацию протеина С. Тромбин, связанный с ТМ теряет свои прокоагулянтные свойства: способность взаимодействовать с PAR1 рецептором и индуцировать агрегацию тромбоцитов, активировать клетки эндотелия и факторы V и VIII (Рис 8 ). Модифицированный тромбомодулином тромбин приобретает антикоагулянтные свойства, быстро превращая протеин С в активную форму- АРС.

ТМ - трансмембранный эндотелиальный белок сосудов, преимущественно капиллярного русла. ТМ обнаружен в печени, легких, сердце, крови и др тканях (Таблица). В структуре тромбомодулина выявлены NH2 домен, подобный лектину, шесть доменов, подобных эпидермальному фактору роста (EGF), домен, связывающий сульфат хондроитина, трансмембранный домен и короткий цитоплазматический хвост. Участок связывания тромбина, необходимый для быстрой активации протеина С, локализован в 5-6 EGF доменах.

За связывание и активацию протеина С тромбином отвечает четвертый EGF домен ТМ (Табл. 3). При активации положительно заряженные участки (петли 37, 60 и 70) протеина С одновременно взаимодействуют с тромбином и ТМ (Рис. 4) .

Таблица 3. Характеристика компонентов системы протеина С.

Белок (кол-во аминокислотных остатков)	Мол вес (кДа)	Суъединицы (кол-во аминокислотных остатков)	Домены	Свойства, распространение
Протеин С (417)	62	Легкая цепь (155)	Гла, 2 EGF	Профермент АРС, протеиназы с антикоагулянтной,противовоспали-тельной и анти-апоптотической активностью. Синтез в печени, почках, эндотелии, кератиноцитах, мозге и др.
		Тяжелая цепь (262)	AP и SP
Протеин S (635)	75	Одна цепь	Гла, TSR, 4 EGF, SHBG (2 LG домена)	Кофактор АРС, связывает C4BP
C4BP (4078)	570	7 α-цепей (549)	8 ССР, 3 ССР	α-цепи – кофакторы фактора I, регулируют систему комплемента
		1 β-цепь (235)		β-цепь связывается с протеином S
Фактор V (2196)	330	До активации – только одна цепь	А1, А2, В, А3, С1, С3	Предшественник прокоагулянта фVа, кофактора фXa; субстрат и кофактор АРС в инактивации фVIIIа
Фактор VIII (2332)	330	Тяжелая цепь (1313)	А1, А2, В, А3, С1, С3	Предшественник прокоагулянта фVIIIa, кофактора фIXa; субстрат АРС
		Легкая цепь (684)
Тромбомодулин (554)	75	Одна цепь	Лектиновый домен, гидрофобный домен, 6 EGF, область, богатая серин/треонином	Трансмембранный белок эндотелиальных клеток, рецептор тромбина при активации РС; обнаружен в печени, легких ,сердце,крови
EPCR (221)	46	Одна цепь	MHC/CD1	Рецептор РС и APC, связывает Гла-домен PС и АРС, ускоряет активацию РС; противовоспалит. св-ва
PCI (387)	60	Одна цепь	Серпин	Ингибитор АРС и др; ингибирует связывание тромбина с ТМ
α-1 AT (394)	60	Одна цепь	Серпин	Ингибитор АРС и других протеиназ

EPCR, рецептор РС, локализован в норме на неповрежденной поверхности эндотелия и связывает протеин C, который активируется комплексом тромбина с ТМ. Блокада связывания протеина С с рецептором EPCR снижает скорость образования АРС в 20 раз.

EPCR – трансмембранный белковый рецептор 1-го типа, сходный по структуре с семейством молекул основного комплекса гистосовместимости класса 1 (CD 1), большинство из которых участвуют в воспалительных ответах организма

В рецепторе EPCR обнаружены две α-спирали и образованный 8 витками карман связывания фосфолипидов, что является необходимым условием для связывания Гла-домена протеина С.

ЕPCR экспрессируется эндотелиальными клетками, моноцитами, нейтрофилами, эозинофилами, гематопоэтическими стволовыми клетками и некоторыами линиями раковых клеток. Концентрация EPCR на поверхности эндотелия варьирует, и возрастает c увеличением толщины сосудов. EPCR участвует в APC-опосредованной активации PAR1 рецепторов и в защите организма от сепсиса. АРС, связаный с поверхностью эндотелия через рецептор EPCR, расщепляет и активирует PAR1 .

Кроме тромбина протеин С может быть активирован фактором Xa и тромбиноподобным активатором из яда щитомордника. При активации расщепляется одна пептидная связь Арг-Лей и освобождается активационный пептид.

На поверхности клеток протеин С находится в комплексе с кофактором- протеином S-(РS) фактором протромбинового комплекса, который не может формировать фермент. В N- конце молекулы РS локализован Гла –домен, отвечающий за связывание молекулы с отрицательно заряженной мембраной клетки. Затем следуют : домен, чувствительный к тромбину, четыре домена, подобные EGF и СООН-концевой домен, гомологичный белкам, семейства андрогенсвязывающих белков человека. РS содержит две пептидные связи, гидролизуемые тромбином. После их расщепления Гла-домен остается связанным с остальной частью молекулы через дисульфидную связь, но РS теряет свои антикоагулянтные свойства.

РS находится в кровотоке в свободной форме, способной связывать РС, и в комплексе со связывающим белком системы комплемента-С4сб. Функция Протеина S - повышать сродство протеина С к фосфолипидам мембраны клеток. Протеин S синтезируется эндотелиальными клетками, мегакариоцитами ,клетками мозга и др.

ФУНКЦИИ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С

На поверхности клеток формируется комплекс фермента - АРС, кофактора- протеина S и субстратов АРС – факторов Va и VIIIa свертывания крови. АРС вызывает протеолиз этих факторов до неактивных форм, не способных ускорять образование тромбина (Рис 8). Нарушение основной антикоагулянтной функции системы протеина С – инактивировать фактор Vа, ведет к развитию тромботических осложнений. Снижение уровня протеина С и протеина S или их структурные аномалии ведут к повышению свертываемости крови.

Несколько лет назад обнаружена патология свертывания крови, названная резистентностью к протеину С. Было показано, что время свертывания плазмы больного с рецидивирующим венозным тромбозом не изменяется после добавления возрастающих концентраций АРС в отличие от плазмы здорового человека, время свертывания которой в подобном эксперименте прогрессивно увеличивается ( вследствие инактивации фактора Va).

Причиной этой резистентности к протеину С была единственная мутация в структуре гена фактора V (замена остатка гуанина в положении 1691 нуклеотида на остаток аденина), которая приводила к замене Arg506 на Gln в молекуле фактора V . Мутантная форма фактора V была названа фактор V Лейден. Этот дефект обнаружен у 20-50% больных с рецидивирующими венозными тромбозами и венозными эмболиями.

В структуре нормальной молекулы фактора Vа ( состоящей из тяжелой и легкой цепей, стабилизированных ионами Са) активированный протеин С расщепляет три пептидные связи в тяжелой цепи в позициях Arg 306,. Arg506 и Arg 679. Инактивация фактора Vа имеет двухфазный характер: быстрая фаза, обусловленная расщеплением в позиции Arg506, приводит к потере 50% активности фактора, а далее следует медленная фаза, связанная с расщеплением при Arg306. При длительной инкубации фактора Vа с АРС расщепляется связь при Arg 679. Инактивация мутантного фактора V Лейден существенно затруднена в связи с не способностью АPС расщеплять пептидную связь при Gln 506 и активировать первую фазу процесса.

При лечении тромбофилии ( склонности к тромбообразованию) варфарином у больных с наследственным дефицитом протеина С может развиваться осложнение - микротромбоз сосудов кожи, обусловленое недостаточностью РС. Известно что время полужизни (Т1/2)РС значительно короче по сравнению с Т1/2 других факторов протромбинового комплекса. Варфарин подавляет синтез этих витамин-К-зависимых факторов и вызывает прежде всего резкое снижение концентрации протеина С. Это приводит к временному повышению свертываемости крови и тромбозу сосудов кожи с последующим инфарктом кожи.

Активированный протеин С, связываясь со специфическим рецептором — эндотелиальным рецептором протеина C (EPCR), приобретает новые противовоспалительные свойства.

Он ингибирует освобождение воспалительных цитокинов (прежде всего фактора некроза опухоли – TNF) в модели воспаления, вызванного эндотоксином. Комплекс активированного протеина С / EPCR блокирует адгезию лейкоцитов,предотвращает инфильтрацию лейкоцитов в ткани и защищает от резкого снижения кровяного давления при введении эндотоксина. Некоторые из этих свойств обусловлены способностью активированного протеина С ( в комплексе с EPCR ) ингибировать транслокацию в ядро транскрипционного фактора NFB, ответственного за синтез провоспалительных цитокинов и адгезивных молекул (Рис). Полифункциональностью активированного протеина С, видимо, объясняется его способность снижать гибель экспериментальных животных и смертность пациентов от сепсиса.

Подобно активированному протеину С его рецептор – EPCR, также проявляет противовоспалительную активность, поскольку блокирует вход ионов кальция в клетку, транслокацию NF kappaB в ядро и модулирует экспрессию генов (блокируя синтез медиаторов воспаления). EPCR может освобождаться из активированного эндотелия индуцибельной металлопротеиназой и в растворимой форме (sEPCR) обнаруживается в плазме. Освобождение sEPCR индуцирует также тромбин, провоспалительные цитокины, токсические окислы кислорода. Растворимый EPCR связывает протеиназу 3 – фермент, подобный эластазе. Этот комплекс взаимодействует с адгезивным интегрином CD11b/CD18 поверхности активированного лейкоцита, препятствуя его связыванию с эндотелием.. Появление свободной формы рецептора АРС может быть составной частью защитных противовоспалительных механизмов.

Исследование кристаллической структуры sEPCR выявило значительное подобие структуре белков семейства MHC класса 1/CD1, большинство из которых участвует в процессах воспаления.

Активированный протеин С оказывает цитпротекторное действие на культивируемые эндотелиальные клетки сосудов мозга, предотвращая их апоптоз, вызываемый гипоксией. Антиапоптотическое действие активированного протеина С при ишемическом повреждениии мозга опосредовано ингибированием (транскрипционно зависимым) р53 (супрессорного опухолевого белка), нормализацией проапоптотического отношения ( Bax/Bcl-2) и снижением активности каспазы –3. Для проявления этого цитпротекторного действия активированного протеина С необходим его эндотелиальный рецептор - EPCR и PAR-1.

Еще один компонент системы протеина С – тромбомодулин, имеет непрямое противовоспалительное действие. Тромбомодулин ускоряет вызываемую тромбином активацию прокарбоксипептидазы в фермент –TAFI – тромбином активируемый ингибитор фибринолиза, который отщепляет карбокси(С-)концевые остатки лизина от фибрина, делая его резистентным к фибринолизу. Кроме того, TAFI(карбоксипептидаза) – основной фермент, ответственный за инактивацию анафилатоксина системы комплемента – С5а, поскольку отщепляет С-концевой Arg и тем самым лишает компонентт С5а его физиологичесой функции(Табл 6). Высокая концентрация тромбомодулина в микроциркуляции, обеспечивающая быструю активацию TAFI и последующую инактивацию С5а, отвечает за защиту микрососудов от повреждения, вызываемого системой комплемента при воспалении.

Более того, тромбомодулин, связывая тромбин, блокирует провоспалительные свойства тромбина, проявляющиеся в его способности индуцировать экспозицию на поверхность эндотелия Р - селектина и фактора, активирующего тромбоциты(PAF).

Связывание тромбина с тромбомодулином драматически повышает скорость его нейтрализации плазменными ингибиторами, прежде всего, антитромбином III, взаимодействующим с углеводной цепочкой (хондроитин сульфатом) тромбомодулина. Комплекс тромбина с ингибитором диссоциирует от тромбомодулина. Кроме того, комплекс тромбина с тромбомодулином подвергается интернализации и деградации.

АРС, наряду с антикоагулянтной, антивоспалительной и антиапоптотической активностями, проявляет профибринолитическую активность, вызывая освобождение тканевого активатора плазминогена из его комплекса с ингибитором. Тканевой активатор плазминогена превращает профермент плазминоген в сериновую протеиназу - плазмин. Фибринолиз- деградация фибрина под действием плазмина.

Эффективность работы антикоагулянтных регуляторных систем ( блокады образования и активности тромбина) , а так же системы фибринолиза, активаторы которого освобождаются из эндотелия, в значительной мере зависит от состояния эндотелия (особенно эндотелия микрососудов), функции которого существенно нарушаются при воспалении ( вызванном бактериальной или вирусной инфекцией, травмой или другими причинами) и других патофизиологических процессах.

Ингибирование АРС осуществяют серпины- ингибитор РС- PCI и α-1 AT .

PCI весьма необычный ингибитор- субстрат, т.к. имеет два P1 остатка, Arg354 и Phe353, поэтому способен узнавать и расщеплять оба класса сериновых протеаз .