Скляночный метод в кислородной модификации
В пресных водоемах широко используется кислородный метод определения первичной продукции. Этот метод предложен Г.Г.Винбергом в 1934 г. в результате исследований на подмосковном озере Белом. На этом озере 25 мая 1932 г. были впервые сделаны измерения фотосинтеза планктона методом склянок для изучения его продукции. Эта работа открыла целую эпоху в гидробиологии и положила начало планомерным продукционным исследованиям различных водоемов. Кислородный метод позволяет определять валовую и чистую продукцию и дыхание планктонного сообщества.
Процедура определения скорости фотосинтеза достаточно проста и позволяет использовать этот метод для широкого его применения в водоемах с относительно высокой концентрацией фитопланктона (в основном, в мезотрофных и эвтрофных). Это необходимо для того, чтобы получить достоверные результаты между начальным и конечным содержанием растворенного кислорода в светлых и темных склянках после инкубационного периода.
По убыли содержания кислорода в темной склянке (по сравнению с исходной) судят о скорости потребления кислорода планктоном, который соответствует скорости минерализации или деструкции органического вещества в процессе дыхания. Разность между концентрацией кислорода в светлой склянке и начальной - это активностъ чистого фотосинтеза (т.е., чистая продукция). Сумма чистой продукции и дыхания - является валовой продукцией (разница между содержанием кислорода в светлой и темной склянках после времени экспозиции).
Таким образом, различие в содержании кислорода является единственной величиной, необходимой для расчета первичной продукции. Поэтому точность измерения концентрации растворенного в воде кислорода является основным условием используемого метода. В связи с этим применение кислородногo метода в олиготрофных водах ограничено из-за невысокой чувствительности. С помощью этого метода можно исследовать только водоемы с высокой биомассой фитопланктона (не менее 1 мг хлорофилла в 1 м3 воды), и, соответственно, высоким уровнем первичной продукции в единице объема воды.
К числу достоинств метода определения первичной продукции кислородным методом следует прежде всегo отнести: высокую точность единичного измерения содержания кислорода в воде (до ± 0,02 мг 02/л) и возможность увеличения времени анализа. Последнее связано с тем, что добавление химических реагентов в продукционную склянку консервирует биологическую активность находящихся там организмов. Сохранение таких фиксированных образцов в течение 2-3 дней допускается после образование осадка окиси марганца в щелочных условиях или даже после выделения свободного йода. Это позволяет зафиксировать содержимое склянок «в поле» так, чтобы после их транспортировки можно было продолжить анализ содержания 02 в лабораторных условиях.
Значительная часть ошибок вызвана длительной (превышающей 6 ч) экспозицией образцов природного фитопланктона. и с наличием пузырьков воздуха или кислорода в склянке. Воздух попадает в склянку в процессе их заполнения водой. Кроме того, пузырьки могут появиться во время экспозиции склянок при резких изменениях температуры. Газообразный кислород появляется за счет интенсивного фотосинтеза, который приводит к пересыщению воды выделившимся кислородом. Пузырек 02, выпущенный из склянки во время фиксирования пробы, может быть источником существенной ошибки анализа. Чтобы избежать этого, необходимо перед открыванием склянки несколько наклонить ее и постараться сместить пузырек в угол склянки под воду. Тогда в момент добавления химических реактивов пузырек останется под слоем жидкости и содержащийся в нем кислород будет зафиксирован.
Процедура определения продукции О2-методом достаточно проста. Исследуемая вода вместе с фитопланктоном со всеми предосторожностями, необходимыми при анализе кислорода, разливается в продукционные склянки с притертыми пробками. Склянки заполняют водой доверху; при притирании пробок следят, чтобы в склянке не оставалось пузырьков воздуха. Для определения продукции необходимо иметь не менее 6-9 склянок. В двух-трех из них фиксируют кислород сразу же после заполнения (для определения его начального количества). Оставшиеся - экспонируют на свету (2-3 склянки) и в темноте (2-3 склянки) в течение определенного периода времени (4-8 ч) в зависимости от интенсивности выделения кислорода фитопланктоном.
Чем выше продуктивность, тем меньше время экспозиции склянки (во избежание пересыщения воды кислородом, поскольку в этом случае возможны его потери из-за выделения в газообразном виде). Кроме того, при длительном времени экспозиции наблюдается подавление жизнедеятельности водорослей и их фотосинтетической активности.
При экспонировании склянок нельзя допускать их нагревание, особенно при работе с природным фитопланктоном.
После экспозиции в каждую склянку добавляют последовательно 1 мл NaOH + KJ и 1 мл МnСl2 для связывания растворенного в воде кислорода (32%-ный расгвор МnСl2; 32%-ный NaOH + 10%-ный KJ). При внесении растворов пипетку следует опустить до дна склянки и быстро вынуть ее с таким расчетом, чтобы во время поднятия пипетки 1 мл раствора был внесен в склянку. Склянки снова закрывают притертыми пробками, чтобы в них не осталось пузырьков воздуха. Содержимое тщательно перемешивают (энергичным переворачиванием) и ставят в темноту на 2 ч для образования осадка. Через 2-3 ч зафиксированный кислород растворяют добавлением 1-3 мл концентрированной серной кислоты и хорошо перемешивают. Выделившийся йод сразу же титруют 0,01 N раствором тиосульфата до появления еле заметной желтой окраски. Затем добавляют 1 мл 0,2%-ного раствора крахмала и жидкость дотитровывают до полного исчезновения синей окраски. Для титрования из продукциониой склянки берут 50 мл жидкости.
Сущность происходящей реакции состоит в следующем:
а) связывание кислорода в щелочной среде:
МnСl2 + 2NaOH = Мn(ОН)2 +2NaC1
2Мn(ОН)2 +02 = 2H2MnO3
б) выделение йода в кислой среде:
H2MnO3 + 2 H2SO4 + 2KJ = MnSO4 + J2 + 3H2O + K2SO4
в) тирование выделившегося йода тиосульфатом:
J2 + 2Na2S2O3 = Na2S406 + 2NaJ
Для приготовления 0,01 N раствора тиосульфата берут 2,48 г соли, растворяют ее дистиллированной водой в 1-литровой колбе. Раствор тиосульфата готовят сначала приблизительно, затем находят для него поправку путем титрования точным раствором бихромата калия (K2Сr207).
Надежность результатов достигается строгим соблюдением необходимых приемов процедуры анализа.
Фиксированные пробы (лучше всего в виде осадка) должны храниться не более суток в темноте, при низкой температуре. Время, необходимое для титрования пробы, и количество индикатора (крахмала), по возможности, должно быть постоянным. Йод является хорошим окислителем, поэтому титрование пробы должно происходить быстро.
Колбу после титрования пробы необходимо тщательно промыть от остатков йода и тиосульфата. То же самое проделывают и со склянками. Их перед опытом тщательно промывают в течение нескольких часов в разбавленном растворе тиосульфата (0,01 N) для удаления следовых количеств йода от предшествующих определений. Затем промывают слабой кислотой и тщательно ополаскивают дистиллированной водой.
Концентрацию кислорода в воде рассчитывают по следующей формуле:
02 (мг/л) = n • К• 0,08•1000 / (V1 - V2),
где: n- количество тиосульфата, пошедшее на титрование пробы (мл);
V1 - объем продукционной склянки (мл);
V2 - объем добавленных в склянку реактивов для фиксирования кислорода (мл);
К - поправка к титру тиосульфата;
0,08 - коэффициент для пересчета тиосульфата в мг кислорода (1 мл тиосульфата эквивалентен 0,08 мг O2 );
1000- перевод мл в литры.