3. Влияние формы и размеров интактных клеток на конечный результат

Большинство биологических объектов доступно для исследования лишь в виде дискретных единиц, которые можно соразмерить с частицами различных порошков. Известно, что спектроскопия НПВО при  θ > θ _кр может быть использована для получения спектров порошков с любым размером частиц. Причем преимущество методов НПВО применительно к порошкам заключается не только в отсутствии рассеяния, с помощью этого метода можно получать спектры порошков с большим размером частиц и поэтому непригодных для исследования методами обычной спектроскопии.

Известно, что контрастность спектров НПВО порошков зависит от размера частиц. Эта зависимость обусловлена характером упаковки частиц. Естественно предположить, что контрастность спектров микроорганизмов будет зависеть от плотности упаковки и их формы. Так, например, даже в случае плотной упаковки шарообразных клеток объем межклеточного пространства занимает около 16%. Естественно также предположить, что при нанесении микроорганизмов на ИЭ из суспензии и подсушивании в токе воздуха при комнатной температуре или при нанесении их на ИЭ в аэрозольной камере, плотность упаковки будет иной, нежели это следует из теоретических расчетов общего объема клеток на поверхности элемента. Т.е. объемная концентрация микроорганизмов на поверхности ИЭ разных микроорганизмов может оказаться различной. Проанализируем интенсивность полос поглощения для клеток различной формы и размеров.

Незаполненное пространство клеточной массой можно определить следующим образом. В основу этого определения положен принцип "подходящего индикатора". Если к нанесенным на поверхность ИЭ микроорганизмам добавить известное количество другого вещества, растворенного в воде, то разность показаний спектрофотометра между оптической плотностью поглощения в аналитической полосе индикатора при отсутствии микроорганизмов и в их присутствии пропорциональна концентрации (объему) сухого вещества клеток или же объему незаполненного пространства.

В качестве индикатора при работе с клетками хорошо использовать сахарозу, имеющую поглощение в области 1100 смˉ¹.

При записи спектров использовали два режима работы: режим "массивного образца" (МО) и "тонкой пленки" (ТП). Рассмотрим их в отдельности.

Режим МО. Если свет проникает в среду, обладающую поглощением, то R = f(d_эф). В этом случае R будет зависеть не только от показателя поглощения К, но также от  θ, относительного показателя поглощения n₂₁ = n₂ / n₁ и числа отражений N, входящих в выражение для d_эф. Т.е. зная перечисленные параметры, не представляет труда рассчитать глубину проникновения луча в среду, состоящую из микроорганизмов и индикатора - сахарозы. Это означает, что при совпадении показателей преломления индикатора и микроорганизмов в анализируемой полосе поглощения стабилизация объема измеряемого вещества происходит автоматически. Коэффициент отражения R, который определяется из эксперимента, прямо пропорционален глубине проникновения. Поэтому после проверки выполнимости закона Бугера-Ламберта-Бера для индикатора в диапазоне оптических плотностей, используемых при определении объема незаполненного клетками пространства, определяем этот объем.

На рис.3.1 представлены спектральные характеристики массивных образцов индикаторов, которые были использованы при определении межклеточного пространства на ИЭ.

На рис.3.2а и 3.2б - спектры некоторых микроорганизмов в присутствии индикаторов (для массивных образцов).

Как следует из полученных спектральных характеристик МНПВО, аналитические полосы индикаторов накладываются на полосы поглощения микроорганизмов. Однако задача количественного определения объема межклеточного пространства разрешима, если оптическая плотность избранной аналитической полосы представляет собой сумму оптических плотностей отдельных компонентов - индикатора и микроорганизмов. Это условие является необходимым и поэтому его выполнение всегда должно быть проверено экспериментально.

Для выбранных аналитических полос можно записать

D = D₁ + D₂ =  α₁d_1эф N +  α₂d_2эфN,

где D₁ и D₂ - оптическая плотность индикатора и микроорганизмов соответственно;

α₁ и  α₂ - показатели поглощения индикаторов и микроорганизмов сосоответственно ( α =  εС, где  ε - экстинкция, л/см _*моль; С - концентрация, моль/л);

d_1эф и d_2эф - соответственно эффективные толщины индикатора и микроорганизмов, см;

N - число отражений.

Оптические плотности индикатора и микроорганизмов (в случае массивных образцов), равные D = -lgR^N =  αd_эфN, определяются из эксперимента для разных ИЭ-тов и микроорганизмов.

Зная D, D₂, а также воспользовавшись зависимостью D₁ = f(V_об), находим объем межклеточного пространства для ряда микроорганизмов с различными размерами и формой, нанесенных на ИЭ. Полученные результаты представлены в таблице 3.1. В таблице представлены наибольшие полученные значения объема межклеточного пространства.

Таблица 3.1.

__________________________________________________________ 

измерительный объем межклеточного пространства,%

 элемент ___________________________________________

 при θ=45^О E.coli Cand.quil. Act.aureof. Chl.vulgar. Spirul.plat.

__________________________________________________________

германий 10 12 20 15 23

кремний 10 10 17 11 20

__________________________________________________________

Анализируя результаты, представленные в таблице, можно заметить, что для измерительных элементов, выполненных из разных материалов, значения объема незаполненного пространства для одних и тех же микроорганизмов несколько отличаются. Это можно объяснить особенностями адсорбции микроорганизмов на поверхности ИЭ-тов.

Может возникнуть вопрос: почему бы не провести измерение объема межклеточного пространства по количественным измерениям объема, занимаемого микроорганизмами, с использованием аналитической полосы поглощения микроорганизмами?

Проведенный анализ оптических плотностей массивных образцов различных микроорганизмов показывает, что имеется некоторое несоответствие между полученными результатами по определению межклеточного пространства с помощью индикатора и по полосам поглощения микроорганизмов. Это можно объяснить тем, что микроорганизмы имеют отличия в процентных отношениях к сухому весу основных биохимических компонентов, ответственных за полосы поглощения, что известно из литературы. Проведенный биохимический анализ на клеточный белок и углеводы подтверждает сделанные выводы. Если же измерения проводятся с заранее известными микроорганизмами (известно процентное содержание основных компонентов по отношению к

сухому весу), то, учитывая их форму и размеры, можно повысить точность количественного анализа.

Обнаруженное различие будет отчасти определяться и следующим. Поскольку разные микроорганизмы имеют отличие по толщине, а ИЭ-ты с разными характеристиками обеспечивают различную глубину проникновения света в анализируемые клетки, то для разных микроорганизмов свет взаимодействует с неодинаковыми цитоструктурными комплексами, содержащими, естественно, неодинаковое количество основных компонентов, образующих эти структуры.

Итак, на основании анализа результатов измерений, проведенных в режиме массивного образца, можно сделать вывод, что объем межклеточного пространства для микроорганизмов с различной формой и размерами, нанесенных на ИЭ-ты, отличается максимально на 13% и что, исходя из средней величины этого разброса (6,5%), можно проводить измерения сред, в которых находятся микроорганизмы, с достаточной для практических целей точностью без учета их формы и размеров.

Режим ТП. При записи спектров в режиме "тонкой пленки" глубина проникновения светового потока d_р  превышает толщину объекта исследования (в конкретном случае толщину микроорганизмов), поэтому представляется возможность определять общее количество основных компонентов клетки независимо от ее формы и размеров. В этом режиме записи спектров наиболее удобно вести количественные измерения, так как интенсивность аналитических полос поглощения будет пропорциональна общему количеству определенного вещества, ответственного за поглощение в выбранной аналитической полосе.

Однако реализация данного режима при записи спектральных характеристик микроорганизмов встречает ряд особенностей, на которых мы остановимся более подробно в следующих разделах.

.