3 .1 Определение лейкоцитов в молоке

Для определения лейкоцитов в специальные центрифужные пробирки наливают 10 см³ профильтрованного через вату молока и центрифугируют 5 мин при 1200 об/мин. Обычно в осадке на дне пробирки сконцентрированы белки молока, лейкоциты, микроорганизмы, частички механической примеси и др. Осадок, полученный при центрифугировании проб молока здоровых коров, обычно имеет

желтоватый цвет. Из осадка платиновой петлей берут пробу и делают на

Рисунок 2.1 – Молоко, содержащее лейкоциты (увеличение в 400 раз)

предметном стекле тонкий мазок, подсушивают его на воздухе, фиксируют и окрашивают раствором метиленового синего (1 см³ насыщенного спиртового раствора краски, растворенной в 30 см3 дистиллированной воды). Далее мазок рассматривают под микроскопом. В молоке больного животного в поле зрения окуляра микроскопа лейкоцитов встречается большое количество: 20-50 лейкоцитов (рисунок 2.1).

3.2 Определение остаточных количеств антибактериальных веществ в молоке с использованием стандартного диффузионного теста «Delvotest»

Агаровая среда в ампулах теста содержит стандартизованное количество спор микроорганизмов Bacillus stearothermophillus var. Calidolactis С 953. Этот вид бактерий обладает высокой чувствительностью к большинству антибиотиков, и, в особенности, к пенициллиновым и другим бета-лактамовым веществам. При хранении в холодных условиях споры остаются жизнеспособными в течение многих месяцев. При повышении температуры до 64⁰С споры быстро размножаются, потребляя присутствующий в среде сахар и высвобождая кислоту в качестве метаболита. Когда количество кислоты становится достаточное, происходит изменение индикаторной среды с фиолетового цвета на желтый цвет. Если проба молока содержит ингибирующие вещества, например, остатки антибиотиков, то они будут распространяться в агаровой среде и, когда их концентрация станет достаточно высокой, они задержат процесс размножения бактерий и образования кислоты. В этом случае цвет теста не изменится на желтый, он останется фиолетовым. Если концентрация ингибитора выше предела обнаружения для этого ингибитора, цвет теста останется фиолетовым. Если концентрация ингибитора близка к пределу обнаружения, тест будет иметь цвет между фиолетовым и желтым.

Исходное молоко осторожно перемешивают во избежание образования пены и пузырьков воздуха. «Delvotest» разработан для объема пробы в 0,1 см³. Чувствительность метода не существенно зависит от точности этого объема, однако желательно, чтобы отклонение составляло не более 10 %. Уровень молока в пипетке в этом случае совпадает с нижним пластмассовым ободком. Капли, образующиеся на конце пипетки, удаляют о внутренний край пробирки с молоком. Проба не должна содержать пену или воздушные пузырьки. Запрещено одной и той же пипеткой отбирать более чем одну пробу.

С помощью ножниц отрезают необходимое количество ампул для проведения анализа, стараясь не повредить фольгу соседних ампул. Промаркировывают ампулы для надлежащей идентификации. Открывают ампулу, прокалывая отверстие в фольге. Отбирают 0,1 см³ молока с помощью одноразовой пипетки для отбора проб молока или дозирующего шприца с одноразовым наконечником. Для этого помещают одноразовый наконечник на дозирующий шприц, полностью нажимают на поршень, погружают наконечник на 1 см в образец молока, медленно отпускают поршень. После того как поршень вернется в начальное положение, капли на конце наконечника удаляют о внутренний край пробирки. Пробу молока в пипетке (0,1 см3 ± 10 %) , избегая образования пены и воздушных пузырей, вводят в соответствующую освобожденную и помеченную ампулу прямо на агаровую среду.

Для уточнения оптимального времени инкубации и для определения антибактериальных веществ на уровне предела обнаружения параллельно с пробами молока исследуют «контрольную пробу». Она представляет собой молоко, свободное от антибактериальных веществ. В качестве такой пробы нельзя использовать воду.

Инкубируют ампулы в термостате или водяной бане при температуре 64±0,5°С в течение времени в соответствии с таблицей 2.1, в которой представлены пределы обнаружения «Дельвотест Р» и «Дельвотест SP» для антибактериальных веществ, при этом определение результата происходит в момент, когда фиолетовый цвет «контрольной» пробы изменился на бледно- желтый (контрольное время) и когда проходит фиксированное время: 2,5 часа, 2,75 часа и 3 часа, соответственно.

Определяют результаты теста по изменению цвета среды в нижней (2/3) части ампулы. Если на поверхности агаровой среды в ампуле появляется узкий темный слой, то им пренебрегают. Определение результата проводят немедленно после извлечения ампулы из нагревателя, используя цветовую карту, прилагаемую к каждому набору. Учет результатов реакции ведется визуально. При использовании отрицательной («контрольной пробы»), она должна оцениваться первой.

Если окраска 2/3 нижней части агара изменилась на желтый цвет, то тест является отрицательным, то есть в образце отсутствуют остаточные количества антибактериальных веществ. Узкую фиолетовую полосу сверху желтого агарового слоя не учитывают, и результат теста оценивают как отрицательный.

Таблица 2.1 – Минимальные уровни обнаружения для «Дельвотеста Р» и «Дельвотеста SP»

Антибактериальное вещество, мг/л молока	«Дельвотест Р»		«Дельвотест SP»
	Контрольное время	2,5 часа	Контрольное время	2,75 часа	3 часа
Пенициллин С	0,0025	0,003	0,002	0,0025	0,0025
Пенициллин G	0,004	0,005	0,003	0,003-0,004	0,003-0,004
Клоксациллин	0,015-0,025	0,025	0,015	0,015-0,025	0,02-0,025
Диклоксациллин	0,015	0,02	0,01	0,01-0,015	0,01-0,015
Оксациллин	0,01	0,01-0,015	0,005	0,01	0,01
Нафциллин	0,005-0,01	0,01	0,005	0,005-0,008	0,01
Ампициллин	0,003-0,004	0,005	0,002-0,003	0,003-0,004	0,003-0,005
Амоксициллин	0,004	0,005-0,006	0,002	0,003-0,005	0,003-0,005
Цефалексин	0,04-0,06	0,06-0,1	0,04-0,06	0,06-0,1	0,06-0,1
Цефалониум	0,01-0,015	0,015-0,02	0,005-0,01	0,01-0,02	0,015-0,025
Цефапирин	0,005	0,008-0,01	0,005	0,005-0,006	0,005-0,01
Цефаперазон	0,04-0,06	0,08	0,04 ч	0,06-0,1	0,06-0,1
Цефацетрил	0,02-0,03	0,03-0,04	0,02	0,02-0,04	0,02-0,04
Тетрациклин	0,05-0,1	0,2-0,8	од	0,2-0,4	0,3-0,6
Окситетрациклин	0,05-0,2	0,3	0,1	0,2-0,4	0,4-0,5
Хлортетрациклин	0,05-0,1	0,25-0,8	0,1-0,15	0,2-0,4	0,3-0,6
Спирамицин	1,0-5,0	5,0- не ч.	0,2	0,35-0,75	не ч.
Дигидрострепто-мицин	2,0-5,0	не ч.	0,3-0,5	1,5-3,0	2,5-10,0
Гентамицин	0,2-0,8	1,0-4,0	ОД-0,3	0,2-0,4	0,4-0,5
Канамицин	7,5- не ч.	не ч.	2,5	7,5	не ч.
Эритромицин	0,3-1,0	0,5-1,5	0,05	0,1-0,15	0,25
Тилозин	0,04-0,15	0,1-0,3	0,01-0,02	0,03-0,05	0,1
Линкомицин	0,1-0,3	0,4-1,0	0,1	0,2	0,3-0,4
Сульфадиазин	не ч.	не ч.	0,05	0,05-0,1	ол
Дапсон	не ч.	не ч.	0,001	0,001-0,004	0,004-0,008
Триметоприм	0,02-0,05	0,5-0,15	0,05	0,1-0,3	0,5

Примечание: «не ч.» - не чувствительно, предел обнаружения - выше 10 частей/млн.

Если окраска 2/3 нижней части агара лишь слегка изменилась и стала желто-фиолетовой, то образец является частично положительным, но концентрация ингибирующего соединения ниже уровня чувствительности теста.

Если окраска содержимого флакона после 3-х часов инкубации осталась фиолетовой, то образец является положительным, что говорит о наличии в пробе остаточных количеств антибиотиков в пределах чувствительности теста.

При использовании «Delvotest» на уровне предельных величин обнаружения оценку результата производят в то время, когда в «контрольной пробе» фиолетовый цвет в нижних 2/3 частях среды полностью исчезнет.