
- •Содержание
- •Предисловие
- •Общие правила техники безопасности при работе в лаборатории
- •Правила работы в лаборатории при выполнении микробиологических исследований
- •1 Цель работы
- •2 Приборы, оборудование и реактивы и пр.
- •3 Общие положения
- •3.1 Методы микробиологического контроля.
- •4 Порядок выполнения работы
- •5 Порядок оформления работы
- •6 Контрольные вопросы
- •1 Цель работы
- •2 Приборы, оборудование и реактивы и пр.
- •3 Общие положения
- •3 .1 Определение лейкоцитов в молоке
- •3.2 Определение остаточных количеств антибактериальных веществ в молоке с использованием стандартного диффузионного теста «Delvotest»
- •3.3 Определение антибиотиков в молоке методом прямого микроскопирования
- •4 Порядок выполнения работы
- •5 Порядок оформления работы
- •6 Контрольные вопросы
- •1 Цель работы Целью работы является проведение санитарно-гигиенического контроля состояния производства.
- •2 Приборы, оборудование и реактивы и пр.
- •3 Общие положения
- •3.1 Санитарно-гигиенический контроль состояния производства традиционными методами Контроль воздуха помещений
- •Контроль чистоты рук персонала методом посева смыва
- •Занятие 1
- •4.1 Порядок выполнения работы
- •Занятие 2
- •4.2 Порядок выполнения работы
- •5 Порядок оформления работы
- •6 Контрольные вопросы
- •1 Цель работы
- •2 Приборы, оборудование и реактивы и пр.
- •3 Общие положения
- •4 Порядок выполнения работы
- •5 Порядок оформления работы
- •6 Контрольные вопросы
- •1 Цель работы
- •2 Общие положения
- •3 Порядок выполнения работы
- •4 Контрольные вопросы
- •Рекомендуемая литература для самоподготовки
- •1 Основная литература
- •2 Дополнительная литература
- •212027, Могилев, пр-т Шмидта, 3.
- •212027, Могилев, пр-т Шмидта, 3.
3 .1 Определение лейкоцитов в молоке
Для определения лейкоцитов в специальные центрифужные пробирки наливают 10 см3 профильтрованного через вату молока и центрифугируют 5 мин при 1200 об/мин. Обычно в осадке на дне пробирки сконцентрированы белки молока, лейкоциты, микроорганизмы, частички механической примеси и др. Осадок, полученный при центрифугировании проб молока здоровых коров, обычно имеет
желтоватый цвет. Из осадка платиновой петлей берут пробу и делают на |
Рисунок 2.1 – Молоко, содержащее лейкоциты (увеличение в 400 раз) |
предметном стекле тонкий мазок, подсушивают его на воздухе, фиксируют и окрашивают раствором метиленового синего (1 см3 насыщенного спиртового раствора краски, растворенной в 30 см3 дистиллированной воды). Далее мазок рассматривают под микроскопом. В молоке больного животного в поле зрения окуляра микроскопа лейкоцитов встречается большое количество: 20-50 лейкоцитов (рисунок 2.1).
3.2 Определение остаточных количеств антибактериальных веществ в молоке с использованием стандартного диффузионного теста «Delvotest»
Агаровая среда в ампулах теста содержит стандартизованное количество спор микроорганизмов Bacillus stearothermophillus var. Calidolactis С 953. Этот вид бактерий обладает высокой чувствительностью к большинству антибиотиков, и, в особенности, к пенициллиновым и другим бета-лактамовым веществам. При хранении в холодных условиях споры остаются жизнеспособными в течение многих месяцев. При повышении температуры до 640С споры быстро размножаются, потребляя присутствующий в среде сахар и высвобождая кислоту в качестве метаболита. Когда количество кислоты становится достаточное, происходит изменение индикаторной среды с фиолетового цвета на желтый цвет. Если проба молока содержит ингибирующие вещества, например, остатки антибиотиков, то они будут распространяться в агаровой среде и, когда их концентрация станет достаточно высокой, они задержат процесс размножения бактерий и образования кислоты. В этом случае цвет теста не изменится на желтый, он останется фиолетовым. Если концентрация ингибитора выше предела обнаружения для этого ингибитора, цвет теста останется фиолетовым. Если концентрация ингибитора близка к пределу обнаружения, тест будет иметь цвет между фиолетовым и желтым.
Исходное молоко осторожно перемешивают во избежание образования пены и пузырьков воздуха. «Delvotest» разработан для объема пробы в 0,1 см3. Чувствительность метода не существенно зависит от точности этого объема, однако желательно, чтобы отклонение составляло не более 10 %. Уровень молока в пипетке в этом случае совпадает с нижним пластмассовым ободком. Капли, образующиеся на конце пипетки, удаляют о внутренний край пробирки с молоком. Проба не должна содержать пену или воздушные пузырьки. Запрещено одной и той же пипеткой отбирать более чем одну пробу.
С помощью ножниц отрезают необходимое количество ампул для проведения анализа, стараясь не повредить фольгу соседних ампул. Промаркировывают ампулы для надлежащей идентификации. Открывают ампулу, прокалывая отверстие в фольге. Отбирают 0,1 см3 молока с помощью одноразовой пипетки для отбора проб молока или дозирующего шприца с одноразовым наконечником. Для этого помещают одноразовый наконечник на дозирующий шприц, полностью нажимают на поршень, погружают наконечник на 1 см в образец молока, медленно отпускают поршень. После того как поршень вернется в начальное положение, капли на конце наконечника удаляют о внутренний край пробирки. Пробу молока в пипетке (0,1 см3 ± 10 %) , избегая образования пены и воздушных пузырей, вводят в соответствующую освобожденную и помеченную ампулу прямо на агаровую среду.
Для уточнения оптимального времени инкубации и для определения антибактериальных веществ на уровне предела обнаружения параллельно с пробами молока исследуют «контрольную пробу». Она представляет собой молоко, свободное от антибактериальных веществ. В качестве такой пробы нельзя использовать воду.
Инкубируют ампулы в термостате или водяной бане при температуре 64±0,5°С в течение времени в соответствии с таблицей 2.1, в которой представлены пределы обнаружения «Дельвотест Р» и «Дельвотест SP» для антибактериальных веществ, при этом определение результата происходит в момент, когда фиолетовый цвет «контрольной» пробы изменился на бледно- желтый (контрольное время) и когда проходит фиксированное время: 2,5 часа, 2,75 часа и 3 часа, соответственно.
Определяют результаты теста по изменению цвета среды в нижней (2/3) части ампулы. Если на поверхности агаровой среды в ампуле появляется узкий темный слой, то им пренебрегают. Определение результата проводят немедленно после извлечения ампулы из нагревателя, используя цветовую карту, прилагаемую к каждому набору. Учет результатов реакции ведется визуально. При использовании отрицательной («контрольной пробы»), она должна оцениваться первой.
Если окраска 2/3 нижней части агара изменилась на желтый цвет, то тест является отрицательным, то есть в образце отсутствуют остаточные количества антибактериальных веществ. Узкую фиолетовую полосу сверху желтого агарового слоя не учитывают, и результат теста оценивают как отрицательный.
Таблица 2.1 – Минимальные уровни обнаружения для «Дельвотеста Р» и «Дельвотеста SP»
Антибактериальное вещество, мг/л молока |
«Дельвотест Р» |
«Дельвотест SP» |
|||
Контрольное время |
2,5 часа |
Контрольное время |
2,75 часа |
3 часа |
|
Пенициллин С |
0,0025 |
0,003 |
0,002 |
0,0025 |
0,0025 |
Пенициллин G |
0,004 |
0,005 |
0,003 |
0,003-0,004 |
0,003-0,004 |
Клоксациллин |
0,015-0,025 |
0,025 |
0,015 |
0,015-0,025 |
0,02-0,025 |
Диклоксациллин |
0,015 |
0,02 |
0,01 |
0,01-0,015 |
0,01-0,015 |
Оксациллин |
0,01 |
0,01-0,015 |
0,005 |
0,01 |
0,01 |
Нафциллин |
0,005-0,01 |
0,01 |
0,005 |
0,005-0,008 |
0,01 |
Ампициллин |
0,003-0,004 |
0,005 |
0,002-0,003 |
0,003-0,004 |
0,003-0,005 |
Амоксициллин |
0,004 |
0,005-0,006 |
0,002 |
0,003-0,005 |
0,003-0,005 |
Цефалексин |
0,04-0,06 |
0,06-0,1 |
0,04-0,06 |
0,06-0,1 |
0,06-0,1 |
Цефалониум |
0,01-0,015 |
0,015-0,02 |
0,005-0,01 |
0,01-0,02 |
0,015-0,025 |
Цефапирин |
0,005 |
0,008-0,01 |
0,005 |
0,005-0,006 |
0,005-0,01 |
Цефаперазон |
0,04-0,06 |
0,08 |
0,04 ч |
0,06-0,1 |
0,06-0,1 |
Цефацетрил |
0,02-0,03 |
0,03-0,04 |
0,02 |
0,02-0,04 |
0,02-0,04 |
Тетрациклин |
0,05-0,1 |
0,2-0,8 |
од |
0,2-0,4 |
0,3-0,6 |
Окситетрациклин |
0,05-0,2 |
0,3 |
0,1 |
0,2-0,4 |
0,4-0,5 |
Хлортетрациклин |
0,05-0,1 |
0,25-0,8 |
0,1-0,15 |
0,2-0,4 |
0,3-0,6 |
Спирамицин |
1,0-5,0 |
5,0- не ч. |
0,2 |
0,35-0,75 |
не ч. |
Дигидрострепто-мицин |
2,0-5,0 |
не ч. |
0,3-0,5 |
1,5-3,0 |
2,5-10,0 |
Гентамицин |
0,2-0,8 |
1,0-4,0 |
ОД-0,3 |
0,2-0,4 |
0,4-0,5 |
Канамицин |
7,5- не ч. |
не ч. |
2,5 |
7,5 |
не ч. |
Эритромицин |
0,3-1,0 |
0,5-1,5 |
0,05 |
0,1-0,15 |
0,25 |
Тилозин |
0,04-0,15 |
0,1-0,3 |
0,01-0,02 |
0,03-0,05 |
0,1 |
Линкомицин |
0,1-0,3 |
0,4-1,0 |
0,1 |
0,2 |
0,3-0,4 |
Сульфадиазин |
не ч. |
не ч. |
0,05 |
0,05-0,1 |
ол |
Дапсон |
не ч. |
не ч. |
0,001 |
0,001-0,004 |
0,004-0,008 |
Триметоприм |
0,02-0,05 |
0,5-0,15 |
0,05 |
0,1-0,3 |
0,5 |
Примечание: «не ч.» - не чувствительно, предел обнаружения - выше 10 частей/млн.
Если окраска 2/3 нижней части агара лишь слегка изменилась и стала желто-фиолетовой, то образец является частично положительным, но концентрация ингибирующего соединения ниже уровня чувствительности теста.
Если окраска содержимого флакона после 3-х часов инкубации осталась фиолетовой, то образец является положительным, что говорит о наличии в пробе остаточных количеств антибиотиков в пределах чувствительности теста.
При использовании «Delvotest» на уровне предельных величин обнаружения оценку результата производят в то время, когда в «контрольной пробе» фиолетовый цвет в нижних 2/3 частях среды полностью исчезнет.