Выявление по реакции гемадсорбции (ргАд)

Реакцию гемадсорбции (РГАд) применяют для индикации в зараженных культурах клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусами, адсорбируются эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию вирусов. Так, например, на клетках, зараженных вирусом натуральной оспы, адсорбируются эритроциты кур; вирусом кори – эритроциты обезьян; аденовирусами – обезьян и крыс и др. (рисунок 3).

1 – островковый тип адсорбции эритроцитов на зараженных клетках; 2 – незаряженные клетки.

Рисунок 3 – Реакция гемадсорбции

Методика РГадс следующая. Из пробирок с зараженными и незараженными культурами клеток удаляют питательную среду и вносят по 0,2 мл 0,4 % взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия трижды отмытых эритроцитов. Пробирки оставляют в наклонном положении на промежуток времени от 20 до 30 мин при температуре 37 С, 22 С или 4 °С. Затем пробирки осторожно встряхивают и исследуют под малым увеличением микроскопа. На клетках монослоя, зараженных вирусом, наблюдается диффузная или локальная адсорбция эритроцитов в виде скоплений, гроздей и розеток. При отрицательном результате на монослое адсорбируются лишь единичные эритроциты. Гемадсорбция предотвращается обработкой зараженного вирусами монослоя специфической сывороткой.

Эта реакция позволяет выявить вирусы до развития ЦПД благодаря адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных гемадсорбирующими вирусами. Эти сложные вирусы имеют в составе супер-капсида специфические гликопротеиды – гемагглютинины (например, орто- и парамиксовирусы). Для воспроизведения РГАд в культуру клеток (контрольную и зараженную вирусом) после определенного для каждого вируса срока инкубации добавляют 0,2 мл 0,5 %-й взвеси эритроцитов так, чтобы был покрыт монослой и оставляют ее на время от 15 до 20 мин при 4 С, 20 С или 37 С (в зависимости от свойств вируса). Затем пробирки встряхивают для удаления неадсорбированных эритроцитов и учитывают под малым увеличением микроскопа скопление их на отдельных клетках или на всем монослое. На незараженных клетках эритроцитов не должно быть. Следует отметить, что не все вирусы, агглютинирующие эритроциты in vitro, способны вызывать гемадсорбцию в культуре клеток. Гемадсорбция наблюдается лишь в том случае, если в процессе взаимодействия вируса с клеткой вирусный гемагглютинин встраивается в структуру наружной клеточной мембраны и тем самым изменяет ее свойства.

Непосредственное выявление вирусных частиц

Выявление по внутриклеточным включениям. Внутриклеточные включения образуются при репродукции некоторых вирусов в цитоплазме и ядре клеток (оспы, бешенства, гриппа, герпеса и др.). Они представляют собой участки локализации вирусов и их компонентов в клетках. Включения обнаруживают при микроскопии после окраски монослоя по Романовскому-Гимзе или другими сложными методами, а также при люминесцентной микроскопии после обработки акридиновым оранжевым (1 : 20000).

Электронно-микроскопическое выявление (ЭМВ). Это исследование дает возможность в зависимости от вида вируса выявить в клетках отдельные вирионы и их кристаллоподобные скопления в ядре или цитоплазме. ЭМВ, как правило, используется для обнаружения возбудителей вирусных инфекций с типичной морфологией (оспенные вирусы), особенно в тех случаях, когда их не удается культивировать обычными методами (вирусы гепатитов А и В, ротавирусы). Вирусы, содержащиеся в исследуемом материале, очищают и концентрируют ультрацентрифугированием, колоночной хроматографией, адсорбцией с помощью специальных сорбентов или антител. Последний способ лежит в основе метода иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

Препараты для ЭМВ готовят методом негативного контрастирования. Для этого смешивают равные объемы вирусной суспензии и 1 %-го раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты («негативная краска») на формваруглеродной подложке. «Краска» окружает вирусную частицу и контрастирует наружную оболочку вириона, а иногда проникает внутрь капсида, в результате чего получают профильное изображение наружной оболочки. Для выявления вирусов в биологическом материале применяют также метод ультратонких срезов.