Лекция 8
Генетическое конструирование in vitro.(продолжение) Локализованный мутагенез.
В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro доза мутагена может быть достаточно высокой, что сильно повышает частоту мутагенеза. Для получения стабильных мутаций в определенном гене можно применять метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминанту устойчивости к антибиотику. Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой ген (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащий указанный детерминант, фланкированный (укомплектованный) последовательностями гомологичными исходному гену. В результате двойного кроссинговера (взаимного обмена участками гомологичных хромосом, основанный на разрыве-соединении хроматид и приводящий к новой комбинации аллелей - рекомбинация) происходит интеграция (встраивание) гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на активных средах с соответствующими антибиотиками. Инактивируемый ген с использованием бактериофага может быть перенесен в другой штамм.
Сайт-специфический мутагенез.
Метод позволяет вводить мутации в точно определенный участок гена (олигонуклеотид-направленный мутагенез), является одним из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген. Для его осуществления необходимо знать: 1) точную нуклеотидную последовательность той области ДНК, которая соответствуют мРНК-кодону, подлежащему изменению; 2) характер аминокислотных замен.
Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием днк фага м13.
Обычно встраивают ген-мишень в двуцепочечную форму вектора на основе бактериофага М13. Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора (плюс-цепь М13) и смешивают ее с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплементарным – за исключением одного нуклеотида – нужному сегменту клонированного гена. Этот отличающийся (т.е. неспаривающийся) нуклеотид соответствует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с комплементарным участком клонированного гена в том случае, если:
он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК;
неспаривающийся нуклеотид находится примерно посередине олигонуклеотида;
отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе;
3’-Конец спарившегося олигонуклеотида служит затравкой для инициации синтеза ДНК, а инактная цепь ДНК М13 – матрицей. Полностью двуцепочечными молекулами ДНК фага М13, содержащими, однако некомплементарные нуклеотиды, трансформируют клетки E. Coli. В последних образуются фаговые частицы, половина популяции образующихся фаговых частиц должна содержать ДНК дикого типа, половина – мутантную ДНК со специфической нуклеотидной заменой. Частицы, содержащие только мутантный ген, идентифицируют при помощи ДНК-гибридизации (спаривание двух молекул ДНК, часто из разных источников, благодаря образованию водородных связей между комплементарными нуклеотидами, используется для выявления специфических последовательностей в препарате ДНК) в жестких условиях, используя в качестве зонда исходный олигонуклеотид. Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспрессирующий E. coli-вектор. Мутантный белок синтезируют в E. сoli и очищают.