1.3. Деякі «індикаторні» білки крові
До цих білків можно віднести тропонін Т та міоглобін, які виявляються в сироватці крові при інфаркті міокарда.
Тропонін Т належить до скорочувальних білків м’язів. У крові навіть при важкому фізичному навантаженні не спостерігається суттєвих змін його концентрації. Тому тропонін Т розглядають виключно як кардіоспецифічний маркер. При інфаркті міокарда зростання концентрації цього білка спостерігається через 3-4 години після больового нападу. Максимальне зростання концентрації - через 3-4 доби. Специфічність методів визначення концентрації тропоніну Т – 901-100%, що значно вище, ніж визначення інших маркерів, таких, як креатинфосфокіназа (КФК), лактатдегідрогеназа (ЛДГ), міоглобін. Крім того, концентрація тропоніну Т після початку інфаркту міокарда зростає значно більше, ніж активність названих ферментів (КФК та ЛДГ). Також зростання концентрації тропоніну Т спостерігається при гострій алкогольній інтоксикації (але не хронічній).
Визначення концентрації міоглобіну має значення не лише для встановлення діагнозу інфаркт міокарда, а й з прогностик-ною метою. Максимальне значення концентрації цього білка виявляють через 4-6 годин після початку захворювання. Встановлено, що висока концентрація міоглобіну в перші години після початку розвитку інфаркту міокарда свідчить про поганий прогноз.
Фракціонування білків сироватки крові
Для визначення білків сироватки крові та виявлення парапротеїнів використовують метод електрофорезу. Цей метод був розроблений А. Тиселіусом, який у 1948 р. за це важливе для медичної практики відкриття отримав Нобелівську премію з хімії.
Електрофорез належить до напівкількісних методів досліджень, що пояснюється деякими технологічними етапами методики. Виходячи з міжнародних стандартів, оцінку результатів проводять візуально шляхом порівняння з електрофореграмою сироватки крові у нормі. Кількісні дані необхідні лише для запису результатів та спостереження динаміки.
Принцип електрофоретичного розділення білків сироватки крові (та інших біологічних рідин) полягає в різниці руху молекул у постійному електричному полі залежно від значення заряду та молекулярної маси. У клінічній практиці найчастіше використовують електрофорез на хроматографіч-ному папері, ацетатцелюлозних мембранах, різних гелях, комбінованих носіях. Електрофорез на папері – це найпростіший метод фракціонування білків, але він має деякі суттєві недоліки.
Для електрофорезу використовують різні прилади, які обладнані комп’ютером, електронним кольоровим сканером, мініатюрною фотокамерою, що підвищує точність досліджень.
Напрямок руху білкових молекул при електрофорезі залежить від значення рН буферного розчину та іонної сили середовища. При рН=8,6 або 8,9 та іонній силі 0,08-0,15 моль/л усі білки сироватки крові мають негативний заряд та рухаються від катода до анода.
Після закінчення електрофоретичного розділення смужки паперу або плівки висушують та профарбовують (наприклад, бромфеноловим синім). Таким чином, отримують смужки, які мають назву електрофореграми, або протеїнограми. Інтенсив-ність забарвлення відповідає концентрації окремих фракцій та визначається за допомогою фотометра або денситометра. На основі отриманих результатів будують графіки кількісного співвідношення окремих фракцій (рис.1).
Результати фіксують у відносних одиницях (%) або абсолют-них значеннях концентрації (г/л). Для отримання достовірних значень та зменшень вірогідності похибок визначення концен-трації проводять у г/л. Для цього відсотковий вміст окремих фракцій перемножують на значення концентрації загального білка у сироватці крові.
Як правило, для фракціонування білків крові використо-вують сироватку, оскільки фібриноген плазми дає смужку в зоні β2-глобулінів, що ускладнює ідентифікацію деяких білків крові, а також може внести похибку при визначенні парапротеїнів.
За допомогою найпростішого методу електрофорезу на папері в сироватці крові здорової людини виявляють 5 фракцій: альбуміни (35-45 г/л, 54-58%);
глобуліни: α1 (3-6 г/л, 6-7%),
α2 (4-9 г/л, 8-9%),
β (6-11 г/л, 13-14%),
γ (7-15 г/л, 11-12%).
При використанні агарозного гелю спостерігають 8 фракцій, при електрофорезі в поліакриламідному гелі – до 17 білкових фракцій. Ще більшу кількість можна отримати за допомогою імуноелектрофорезу, який є найбільш інформативним для вияв-лення мінімальних концентрацій аномальних імуноглобулінів (парапротеїнів), наприклад, при мієломі або хворобі Вальден-стрема.
Нижче на рис. 1(а) наведена електрофореграма (протеїно-грама, денситограма) білків сироватки крові здорової людини, яку отримують за допомогою електрофорезу на папері (5 фракцій).
Рисунок 1 - Електрофореграма білків сироватки крові у нормі (а) та при мієломі (б, в)
На агарових пластинах виділяють 6 фракцій – бета-зона поділяється на дві β1- та β2-.
Основні білки, які входять до складу кожної фракції, такі:
Альбумінова: альбуміни;
Альфа-1-зона: альфа-1-антитрипсин, орозомукоїд, альфа-1-антихімотрипсин;
Альфа-2-зона: гаптоглобін, церулоплазмін, альфа-2-макро-глобулін, альфа-ліпопротеїни;
Бета-1-зона: трансфери-гемопексин;
Бета-2-зона: беталіпопротеїн, С3-компонент комплемен-ту;
Гамма-зона: IgG, IGA, Ig M, IgD, IgE.
Рухомість деяких білків може змінюватись (особливо альбумінів) при їх зв’язуванні з лікарськими препаратами або іншими лігандами (наприклад, білірубіном). Це призводить до формування додаткових смуг на електрофореграмі.
Протеїнограми розглядають як додатковий діагностичний тест, тому що їх значення для діагностики та контролю лікування досить суперечливе. Виняток існує лише для парапротеїнемії, коли використання електрофорезу має значну діагностичну цінність.